核酸扩增反应装置和核酸扩增方法

核酸扩增反应装置和核酸扩增方法
【专利摘要】本发明提供新型的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。本发明的核酸扩增反应装置具备：（A）具有安装具备管和核酸增幅反应器的筒的安装部的旋转体和（B）在上述核酸扩增反应容器的内部形成温度梯度的加热器，其中，所述管具有使含有上述核酸从核酸结合的核酸结合性固相载体溶出的溶出液的塞子，所述核酸扩增反应容器与上述管连通且包含与上述溶出液相分离的油；并且，（C）通过使上述旋转体旋转而改变上述筒的姿势，从而使含有从上述管导入的上述溶出液的液滴，在上述核酸扩增反应容器的内部移动。
【专利说明】核酸扩增反应装置和核酸扩增方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。

【背景技术】
[0002] 专利文献1、2中公开了通过使填充有反应液和与反应液相分离且比重比反应液 小的油的生物芯片旋转，从而使反应液在生物芯片的内部移动而实施热循环的装置。然而， 专利文献1、2中对于在生物芯片的内部封入(分注）反应液为止的处理没有予以考虑。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1 :日本特开2009-136250号公报
[0006] 专利文献2 :日本特开2012-115208号公报


【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供新型的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
[0008] 用于实现上述目的的主要发明是一种核酸扩增反应装置（D)，具备：（A)具有安装 具备管和核酸扩增反应容器的筒的安装部的旋转体，所管具有含有使上述核酸从核酸结合 的核酸结合性固相载体溶出的溶出液的塞子，所述核酸扩增反应容器与上述管连通且含有 与上述溶出液相分离的油；以及（B)在上述核酸扩增反应容器的内部形成温度梯度的加热 器，并且，（C)通过使上述旋转体的旋转而改变上述筒的姿势，从而使含有从上述管导入的 上述溶出液的液滴在上述核酸扩增反应容器的内部移动。
[0009] 对于本发明的其它特征，通过本说明书和附图的记载可清楚地了解。

【专利附图】

【附图说明】
[0010] 图1的图1A和图1B是筒1的说明图。
[0011] 图2的图2A?图2C是筒1的动作说明图。
[0012] 图3的图3A?图3D是罐3的说明图。
[0013] 图4是固定爪25和导板26与安装部62的说明图。
[0014] 图5的图5A和图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0015] 图6的图6A是PCR装置50的内部构成的立体图。图6B是PCR装置50的主要构 成的侧视图。
[0016] 图7是PCR装置50的框图。
[0017] 图8的图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62中安装有 筒1的状态的说明图。
[0018] 图9的图9A?图9D是安装筒1时的PCR装置50的状态的说明图。
[0019] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的概念图。
[0020] 图11的图11A?图11C是核酸溶出处理的说明图。
[0021] 图12是摆动磁铁71时的磁珠7的举动的概念图。
[0022] 图13是表示磁铁71有无摆动的表。
[0023] 图14的图14A?图14C是液滴形成处理的说明图。
[0024] 图15的图15A和图15B是热循环处理的说明图。
[0025] 图16的图16A和图16B是第2实施方式的筒1的说明图。
[0026] 图17的图17A是第2实施方式的筒1的初始状态的说明图。图17B是从图17A 的状态按压柱塞10,密封12A与下注射筒22接触时的侧视图。图17C是按压柱塞10后的 第2实施方式的筒1的说明图。
[0027] 图18的图18A和图18B是第2实施方式的PCR容器30的周边的说明图。
[0028] 图19是表示在一个实施例中使用的核酸提取用试剂盒及其组装后的装置的图。
[0029] 图20是表示一个实施例中的实时PCR的结果的图。

【具体实施方式】
[0030] 根据本说明书和附图的记载，至少明确以下事项。
[0031] 明确了一种（D)核酸扩增反应装置，具备（A)具有安装具备管和核酸扩增反应容 器的筒的安装部的旋转体，所述管具有含有使上述核酸从核酸结合的核酸结合性固相载体 溶出的溶出液的塞子，所述核酸扩增反应容器与上述管连通且含有与上述溶出液相分离的 油；和（B)在上述核酸扩增反应容器的内部形成温度梯度的加热器，并且，（C)通过使上述 旋转体旋转而改变上述筒的姿势，从而使含有从上述管导入的上述溶出液的液滴在上述核 酸扩增反应容器的内部移动。
[0032] 根据这样的装置，由于使核酸扩增反应容器的姿势与进行核酸溶出处理的管一起 变化，所以能够缩短处理时间。
[0033] 上述旋转体的旋转轴优选位于比上述核酸扩增反应容器还靠上述管侧。这样，能 够使旋转体小型化。
[0034] 上述安装部优选具有固定上述管的管固定部和固定上述核酸扩增反应容器的容 器固定部。这样，筒被稳定地固定。
[0035] 上述加热器优选设置于上述旋转体。这样，形成于核酸扩增反应容器的内部的温 度梯度稳定。
[0036] 优选设置对安装于上述安装部的上述筒的上述塞子进行加热的溶出用加热器。这 样，促进核酸从核酸结合性固相载体游离。
[0037] 优选进一步具有使磁铁沿上述管移动的磁铁移动机构。这样，能够利用磁铁移动 机构使核酸结合性固相载体在管内移动。
[0038] 上述磁铁移动机构优选使上述磁铁摆动而改变上述磁铁与上述管的距离。这样， 能够调整核酸结合性固相载体在管的内部的凝聚?扩散。
[0039] 优选进一步具有为了将液体从上述管推到上述核酸扩增反应容器而按压设置于 上述筒的柱塞的按压机构。这样，能够利用按压机构将管内的液体导入到核酸扩增反应容 器。
[0040] 明确了一种核酸扩增方法，（A)将具备管和核酸扩增反应容器的筒安装于安装部， 所述管具有含使上述核酸从核酸结合的核酸结合性固相载体溶出的溶出液的塞子，所述核 酸扩增反应容器与上述管连通且含有与上述溶出液相分离的油，并且，通过（B)在上述核 酸扩增反应容器的内部形成温度梯度，（C)使具有上述安装部的旋转体旋转而改变上述筒 的姿势，从而使含有从上述管导入的上述溶出液的液滴在上述核酸扩增反应容器的内部移 动。
[0041] 根据这样的方法，由于使核酸扩增反应容器的姿势与进行核酸溶出处理的管一起 变化，所以能够缩短处理时间。
[0042] 第1实施方式
[0043] 首先，对安装于PCR装置50 (核酸扩增反应装置）的筒进行说明，然后对本实施方 式的PCR装置50的构成?动作进行说明。
[0044] 筒 1
[0045] 图1A和图1B是筒1的说明图。图2A?图2C是筒1的动作说明图。图2A是筒 1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10,密封12A与下注射筒22接触 时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的筒1的说明图。
[0046] 筒1是进行使核酸从核酸结合的磁珠7中溶出的核酸溶出处理的容器，并且是对 成为PCR溶液的反应液47进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。
[0047] 核酸提取处理在罐3中进行，在通过管20期间进行精制。管20的材质没有特别 限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是选择透明的玻璃、树脂作为管20的材 质，则能够从管20的外部观察内部，因而更优选。另外，如果选择使磁力透过的物质、非磁 性体作为管20的材质，则使磁性粒子通过管20等时，通过从管20的外部给予磁力而容易 使磁性粒子通过管，因而优选。另外，对于管的材质，由于附近配置有加热器(后述的溶出用 加热器65A、高温侧加热器65B)，所以优选具有至少KKTC以上的耐热性。应予说明，管20 的材质可以与罐的材质相同。
[0048] 管20具有清洗液塞子45、反应液塞子47以及油塞子。由于核酸结合的磁珠7被 外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁沿管20在外部移动，从而使磁珠7在管20内移动，将其 通过清洗液塞子45而到达反应液塞子47。与磁珠7结合的核酸在清洗液塞子45被清洗液 清洗，在反应液塞子47溶出。在此，"塞子"是指在管20内特定的液体占一个分区时的液 体。例如，图2A?图2C中将在毛细管23内保持为柱状的液体称为"塞子"。应予说明，油 与其它溶液相分离(不与其它溶液混和)，因此，由油构成的塞子具有防止其两侧的水溶性 的塞子相互混合的功能。优选在塞子中、塞子间没有气泡、其它液体，但只要磁珠7能够通 过塞子，也可以存在气泡、其它液体。
[0049] 油的种类没有特别限定，可以使用矿物油、硅油（2CS硅油等)，植物油等，通过成为 更高粘度的油，从而在与上侧塞子的界面，使核酸结合性固相载体移动时能够提高油带来 的"洗刷效果"。由此，能够使核酸结合性固相载体从上侧的塞子移动到由油构成的塞子时， 更不易将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带入油内。
[0050] 热循环处理在筒1的PCR容器30中进行。PCR容器30被油填满，反应液47与该 油相分离，因此反应液塞子47被从管20推到PCR容器30中时成为液滴状，另外，由于比重 比油大，所以成为液滴状的反应液47进行沉降。如果利用外部的加热器在PCR容器30形 成高温区域36A和低温区域36B，反复使筒1整体与加热器一起上下翻转，则液滴状的反应 液47在高温区域36A与低温区域36B之间交替移动，对作为PCR溶液的反应液47实施2 阶段的温度处理。
[0051] PCR容器30的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，因 为在附近有高温侧加热器65B，所以优选PCR容器30的材质具有至少100°C以上的耐热性。 如果PCR容器30的材质选择透明或半透明的材质，则荧光测定(亮度测定）变得容易，因而 优选。但是，无需将PCR容器30的全部区域为透明或半透明，至少将与荧光测定器55相 对的部位(例如PCR容器30的底35A)为透明或半透明即可。应予说明，PCR容器30的材 质可以与罐3、柱塞10的材质相同。
[0052] 筒1由罐3和筒主体9构成。对构成筒1的试剂盒，与罐3和筒主体9 一起预先 准备适配体5。通过介由适配体5连接罐3和筒主体9,从而组装筒1。其中，也可以是直接 在筒主体9安装罐3的构成。
[0053] 在以下的筒1的构成要素的说明中，如图2A所示，以沿长条的筒1的方向为"长边 方向"，以罐3侧为"上游侧"，以PCR容器30侧为"下游侧"。应予说明，有时将上游侧简单 表示为"上"，将下游侧简单表示为"下"。
[0054] ( 1)罐
[0055] 图3A?图3D是罐3的说明图。
[0056] 在试剂盒预先准备的罐3中收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的开口安装有可卸 下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2%Triton X-100、50mM Tris-HCl (pH7. 2)。操作者取下盖3A打开罐3的开口（参照图3B)，将附着病毒的棉棒浸入罐3内的 溶解液41，采集病毒到溶解液41中（参照图3C)。搅拌罐3内的液体时，可以在图3C的状 态下振荡罐3,但这样做溶解液41容易溢出，因而如图3D所示，优选将带盖5A的适配体5 安装在罐3的开口后振荡罐3。这样，罐3内的物质被搅拌，病毒粒子被溶解液41溶解，核 酸游离，同时涂覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁珠7相当于核酸结合性固相载体。然 后，操作者取下安装于罐3的开口的适配体5的盖5A，介由适配体5将罐3安装于筒主体9 (参照图2A)。
[0057] 罐3由具有挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。当柱塞10滑动而从图2A的状态成 为图2B的状态时，通过罐3膨胀，能够抑制管20内的液体的压力过度上升，抑制管20内的 液体被推到下游侧。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。
[0058] 应予说明，提取?扩增核酸的试样不限于病毒，也可以是细胞。细胞的来源没有特 别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。
[0059] 另外，溶解液41只要含有离液物质就没有特别限定，出于破坏细胞膜或使细胞中 含有的蛋白质变性的目的，可以含有表面活性剂。作为该表面活性剂，通常只要是从细胞等 提取核酸时使用的表面活性剂就没有特别限定，具体而言，可举出Triton-X等Triton系表 面活性剂、T Ween20等Tween系表面活性剂那样的非离子性表面活性剂、N-月桂酰肌氨酸钠 (SDS)等阴离子性表面活性剂，特别优选以成为0. 1?2%的范围的方式使用非离子性表面 活性剂。此外，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂。溶解液也可以是缓 冲液，优选是PH6?8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含有3?7M的胍盐、0?5% 的非离子性表面活性剂、〇?〇. 2mM的EDTA、0?0. 2M的还原剂等。
[0060] 离液物质只要在水溶液中生成离液离子(离子半径大的1价的阴离子)，具有增加 稀疏水性分子的水溶性的作用，有助于核酸对固相载体的吸附就没有特别限定。具体而言， 可举出硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变性作用强的硫 氰酸胍或盐酸胍。这些离液物质的使用浓度根据各物质而有所不同，例如使用硫氰酸胍时， 优选以3?5. 5M的范围使用，使用盐酸胍时，优选以5M以上使用。
[0061] 另外，采集试样的器具没有特别限定，可以根据用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉 棒。
[0062] 罐3的内容积没有特别限定，例如可以为0. lmL?100mL。罐3的材质没有特别 限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是选择透明的玻璃、树脂作为罐的材质， 则能够从罐3的外部观察内部，因而更优选。应予说明，罐3和各管20可以一体成形，也可 以是能够装卸。如果利用橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料作为罐3的材质，则在罐 3安装有盖的状态下使罐3变形，从而能够对罐3的内部加压。由此，能够从管的前端侧将 管20的内容物从管的内部向外部推出。
[0063] (2)筒主体
[0064] 筒主体9具有柱塞10、管20以及PCR容器30。
[0065] (2-1)柱塞
[0066] 以下，参照图2A?图2C对柱塞10进行说明。
[0067] 柱塞10是将液体从作为注射筒发挥功能的管20的下游侧推出的可动式的推杆。 柱塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外， 柱塞10还具有介由适配体5安装罐3的功能。
[0068] 柱塞10具有筒状部11和棒状部12。筒状部11设置于罐3侧(上游侧)，棒状部 12设置于管20侧(下游侧)。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被板状的2个凸缘13 支撑。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。
[0069] 筒状部11在上游侧和下游侧开口，筒状部11的内壁成为液体的通路。在筒状部 11的上游侧(罐3侧）的开口嵌合适配体5。在试剂盒预先准备的筒主体9的柱塞10上可 以安装能够在筒状部11的上游侧的开口可卸下的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20 的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部， 穿过凸缘13的表里而从筒状部11的下游侧的开口出来，导入到管20的上注射筒21。
[0070] 筒状部11的下游侧嵌合于管20的上注射筒21的内壁。筒状部11内接于管20 的上注射筒21，并且相对于上注射筒21能够在长边方向滑动。
[0071] 在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有安装适配体5的安装台11A。另外，安 装台11A也是在按压柱塞10时被按压的部位。通过按压安装台11A，从而柱塞10相对于管 20滑动，从图2A的状态变为图2C的状态。柱塞10向下游侧移动时，安装台11A接触管20 的上缘(参照图2C)。换言之，柱塞10的安装台11A与管20的上缘的间隔成为柱塞10的滑 动长度。
[0072] 棒状部12在初始状态时位于管20的上注射筒21的内部，与下注射筒22分离(参 照图2A)。如果柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12插入到管20的下注射筒22,棒状部 12内接于下注射筒22的同时相对于下注射筒22向下游方向滑动(参照图2B和图2C)。
[0073] 棒状部12的与长边方向正交的截面的形状为圆形。但是，棒状部12的截面形状 只要能够嵌合于管20的下注射筒22的内壁，就可以是圆、椭圆、多边形，没有特别限定。
[0074] 在棒状部12的下游侧的端部形成有密封12A。密封12A嵌合于下注射筒22时，防 止下游侧的管20内的液体向上注射筒21逆流。并且，柱塞10从图2B的状态被推到图2C 的状态时，其间与密封12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20内的液体从下游侧被 推出。
[0075] 应予说明，密封12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体从下游侧被推出 的量)比管20内的反应液塞子47和第3油塞子48的总计多。由此，能够以反应液47不残 留在管20的方式推出管20内的液体。
[0076] 柱塞10的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，柱塞 10的筒状部11和棒状部12可以由相同的材质一体形成，也可以由不同材质形成。在此，通 过将筒状部11和棒状部12用树脂分别成型，介由凸缘13接合筒状部11和棒状部12,从而 形成柱塞10。
[0077] 在柱塞10的内部预先收容有油42和第1清洗液43。由于柱塞10内的油42的 比重比第1清洗液43小，所以将罐3安装在筒主体9时，如果以柱塞10的安装台11A为 上方使筒主体9立起，则如图2A所示，在罐3内的液体与筒主体9的第1清洗液43之间 将会配置油42。应予说明，作为油42,使用2CS娃油，作为第1清洗液43,使用8M盐酸胍、 0· 7%Triton X-100。
[0078] 应予说明，第1清洗液43是与油42和油44中的任一种混合时发生相分离的液体 即可。第1清洗液43优选为水或低盐浓度水溶液，为低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。 低盐浓度水溶液的盐浓度优选为l〇〇mM以下，更优选为50mM以下，最优选为10mM以下。另 夕卜，低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，优选为〇. ImM以上，进一步优选为〇. 5mM以上， 最优选为ImM以上。另外，该溶液可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，pH没有特别 限定。用于形成缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。此 夕卜，该清洗液优选含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的醇。此时， 醇浓度没有特别限定，可以为70%以下，60%以下，50%以下，40%以下，30%以下，20%以下， 10%以下，优选为5%以下或2%以下，进一步优选为1%以下或0. 5%以下，最优选为0. 2%以 下或0. 1%以下。
[0079] 应予说明，第1清洗液43中可以含有离液剂。例如，如果在第1清洗液43中含有 盐酸胍，则能够维持或强化吸附于粒子等的核酸的吸附，同时能够清洗粒子等。作为含有盐 酸胍时的浓度，例如可以为3mol/L?10mol/L，优选为5mol/L?8mol/L。如果盐酸胍的浓 度是该范围，则能够使吸附于粒子等的核酸更稳定地吸附，并且清洗其它夹杂物等。
[0080] (2-2)管
[0081] 以下，参照图2A?图2C对管20进行说明。
[0082] 管20是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注 射筒22以及毛细管23,各部的内径阶段性不同。
[0083] 上注射筒21是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。能在上注射筒21的内 壁可滑动地内接柱塞10的筒状部11，上注射筒21作为与柱塞10的筒状部11配合的注射 筒发挥功能。
[0084] 下注射筒22是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。在下注射筒22的内壁 上柱塞10的棒状部12的密封12A能够可滑动地嵌合，下注射筒22作为相对于柱塞10的 棒状部12的注射筒作为发挥功能。
[0085] 毛细管23是能够使液体在长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径是液 体能够维持塞子的形状的大小，这里为1. 〇mm。在毛细管23的末端(管20的下游侧的端)， 与此相比内径变小，这里为0. 5mm。毛细管23的末端的内径设定为比后述的液滴状的反应 液的直径（1.5?2. 0mm)小。由此，反应液塞子47从毛细管23的末端被推出时，能够避免 液滴状的反应液附着在毛细管23的末端或逆流到毛细管23内。
[0086] 应予说明，毛细管23只要是在内部具有空腔、具有能够使液体在长边方向流通的 筒状的形状即可，可以在长边方向弯曲，但优选为直线状。管的内部的空腔只要能够使液体 在管内维持塞子的形状，对其大小、形状均没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边 方向垂直的截面的形状可以沿管的长边方向变化。
[0087] 管的外形与长边方向垂直的截面的形状也没有限定。并且管的壁厚(从内部的空 腔的侧面到外部的表面的尺寸）也没有特别限定。管为圆筒状时，其内径(与内部的空腔的 长边方向垂直的截面的圆的直径）例如为0. 5mm?2mm。管的内径为该范围，则管的材质、 在广范的范围内的液体的种类上都容易形成液体的塞子。优选前端变细为锥状，可以为 0· 2mm?1mm。并且，通过减小毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)，从而能够抑 制在PCR容器30内液滴化了的反应液47吸附于毛细管23的开口而不脱离。但是，如果过 度减小毛细管23的末端的内径，则形成大量小液滴的反应液47。应予说明，如果使毛细管 23的末端以外的部分也与末端同样地进行细径化，则从确保各塞子的体积的必要性考虑， 筒1将变长，因而不优选。
[0088] 毛细管23在内部从上游侧依次具备第1油塞子44、清洗液塞子45、第2油塞子 46、反应液塞子47、第3油塞子48。换言之，在水溶性的塞子(清洗液塞子45或反应液塞子 47)的两侧配置油塞子。
[0089] 应予说明，在第1油塞子44的上游侧的上注射筒21和下注射筒22中预先收容 有油42和清洗液43 (参照图2A)。上注射筒21和下注射筒22的内径比毛细管23的内径 大，上注射筒21和下注射筒22中液体(油42和清洗液43)无法维持塞子那样的柱状，但第 1油塞子44通过毛细管23以塞子的形状保持，因此抑制构成第1油塞子44的油向上游侧 移动。
[0090] 清洗液塞子45可以由作为第2清洗液的5mM的Tris盐酸缓冲液形成，第2清洗 液可以是基本上与第1清洗液中叙述的成分相同的构成，可以与第1清洗液相同，也可以不 同，优选事实上不含有离液物质。这是为了不将离液物质带入其后的溶液。如上所述，该 清洗液也优选仅含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的醇。此时， 醇浓度没有特别限定，可以为70%以下，60%以下，50%以下，40%以下，30%以下，20%以下， 10%以下，优选为5%以下或2%以下，更优选为1%以下或0. 5%以下，最优选为0. 2%以下或 0. 1%以下。
[0091] 清洗液塞子45可以由被油的塞子断开的多个塞子构成。清洗液塞子45由多个塞 子构成时，各塞子的液体可以相同，也可以不同。其中，只要至少有1个清洗液的塞子，则对 其它塞子的液体就没有特别限定，优选全部塞子为清洗液。分割清洗液塞子45的数目例如 可以考虑管20的长度、清洗的对象等适当地设定。
[0092] 反应液塞子47例如由以下反应液构成。
[0093] 0.2uy>L AMV 逆转录酶（NffPON GENE ) 0.125u/.?L GENETaq NT PCIl 酶（NWPON GENE) 0. 6nM dNTP Ι.β/ιΜ 引物（forward) 1. _麗 引物 (reverse ) 0·5/ιΜ 探针（Taq man ) Ulmg/niL BSA xl 缓冲液（MgCI2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCI 50mM )
[0094] 反应液47是指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到溶液中，进行 逆转录反应和聚合酶反应的液体。因此，以核酸溶出后的反应液47直接成为用于逆转录反 应和聚合酶反应的缓冲溶液的方式预先制备。反应液47中含有使核酸溶出的溶出液。
[0095] 反应液47用于逆转录反应，可以含有逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物(寡聚 核苷酸)，另外，用于聚合酶反应，可以含有DNA聚合酶和DNA聚合酶用引物(寡聚核苷酸)， 还可以含有TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR绿等嵌入 剂用荧光色素。此外，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA (牛血清白蛋白）或者明胶。溶 剂优选水，更优选事实上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质。另外，优选含有盐以 形成逆转录酶用缓冲液和/或DNA聚合酶用缓冲液。用于形成缓冲液的盐只要不阻碍酶反 应，就没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。逆转录酶没有特别限定， 例如可以使用来自禽成髓细胞瘤病毒（Avian Myeloblast Virus)、Ras相关病毒2型（Ras Associated Virus2型)、莫洛尼小鼠白血病病毒（Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、 人类免疫缺陷病毒1型（Human Immunodefficiency Virusl型)的逆转录酶等，优选耐热性 的酶。DNA聚合酶也没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如，有Taq聚合酶、Tf i聚 合酶、Tth聚合酶或者它们的改良型等大量市售品，优选进行热启动的DNA聚合酶。
[0096] DNA聚合酶用引物可以针对检测的DNA容易地决定适当的序列。通常，为了扩增1 种DNA，可以含有5'端的引物和3'端的引物的引物对。应予说明，为了扩增多种DNA，可以 通过预先含有用不同荧光色素标记的多种引物对而对应于多重PCR。此时，将TaqMan探针 适当地为多个即可。
[0097] 反应液中含有的dNTP、盐的浓度是对于使用的酶为适当的浓度即可，通常，使 dNTP为10?1000 μ M，优选为100?500 μ M，使Mg2+为1?lOOmM，优选为5?10mM，使 C1-为1?2000mM，优选为200?700mM即可，总离子浓度没有特别限定，可以为大于50mM 的浓度，优选为大于l〇〇mM的浓度，更优选为大于120mM的浓度，进一步优选为大于150mM 的浓度，更进一步优选为大于200mM的浓度。上限优选为500mM以下，更优选为300mM以 下，进一步优选为200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0. 1?10 μ M，优选使用0. 1? ΙμΜ。BSA或明胶的浓度为lmg/mL以下时，反应阻碍防止效果变小，如果为lOmg/mL以上， 则可能阻碍逆转录反应及其后的酶反应，因而优选为1?10mg/mL。使用明胶时，作为其来 源可例示牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以加温溶解。
[0098] 反应液塞子47的体积没有特别限定，可以以吸附核酸的粒子等的量等作为指标 适当地设定。例如，粒子等的体积为〇. 5 μ L时，反应液塞子47的体积只要为0. 5 μ L以上 就够了，优选为〇. 8 μ L?5 μ L，更优选为1 μ L?3 μ L。只要反应液塞子47的体积为这些 范围，例如，即使核酸结合性固相载体的体积为0. 5 μ L，也能够使核酸从载体充分溶出。
[0099] 毛细管23的下游部插入到PCR容器30。由此，通过从管20推出管20内的反应液 塞子47,从而能够将反应液47导入到PCR容器30中。
[0100] 通过毛细管23的外壁的环状的凸部与PCR容器30的内壁接触而形成上密封部。 另外，通过使上密封部还下游侧的毛细管23的外壁与PCR容器30的内壁接触而形成下密 封部。上密封部和下密封部在后面阐述。
[0101] 管20进一步具有固定爪25和导板26。图4是固定爪25和导板26与安装部62 的说明图。
[0102] 固定爪25是将筒1固定在安装部62的部件。如果筒1插入安装部62直到固定 爪25卡住，则筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。换言之，当筒1相对于安装部62 位于异常的位置时，固定爪25将不卡在安装部62上。
[0103] 导板26是将筒1安装在PCR装置50的安装部62时引导筒1的部件。在PCR装 置50的安装部62形成有导轨63Α，管20的导板26沿导轨63Α进行引导，同时筒1插入安 装部62而被固定。筒1为长条形状，由于筒1 一边被导板26引导一边插入到安装部62,所 以容易将筒1相对于安装部62固定在正常的位置。
[0104] 固定爪25和导板26是从毛细管23的左右突出的板状的部件。用磁铁使管20内 的磁珠7移动时，使磁铁从板状的固定爪25、导板26的垂直方向接近。由此，能够使磁铁与 管20内的磁珠7的距离接近。但是，只要是使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近，固定爪 25和导板26也可以是其它形状。
[0105] (2_3)PCR 容器
[0106] 图5A和图5B是PCR容器30的周边的说明图。图5A是初始状态的说明图。图5B 是按压柱塞10后的状态的说明图。以下，参照图2A?图2C对PCR容器30进行说明。
[0107] PCR容器30是接受从管20推出的液体的容器，并且是在热循环处理时收容反应液 47的容器。PCR容器相当于核酸扩增反应容器。
[0108] PCR容器30具有密封形成部31和流路形成部35。密封形成部31是插入管20的 部分，是抑制从流路形成部35溢出的油向外部泄漏的部位。流路形成部35是比密封形成 部31还下游侧的部分，是形成液滴状的反应液47移动的流路的部位。PCR容器30相对于 管20在密封形成部31的上密封部34A和下密封部34B这2个位置被固定。
[0109] 密封形成部31具有油接受部32和阶梯部33。
[0110] 油接受部32是筒状的部位，作为接受从流路形成部35溢出的油的腔室发挥功能。 在油接受部32的内壁与管20的毛细管23的外壁之间有间隙，该间隙成为接受从流路形成 部35溢出的油的油接受空间32A。油接受空间32A的体积比柱塞10的密封12A在管20的 下注射筒22滑动的体积大。
[0111] 通过油接受部32的上游侧的内壁与管20的环状的凸部接触，形成上密封部34A。 上密封部34A是允许空气通过且抑制油接受空间32A的油向外部泄漏的密封。上密封部 34A以油因油的表面张力而不泄漏的程度形成通气口。上密封部34A的通气口可以是管20 的凸部与油接受部32的内壁之间的间隙，也可以是形成于管20的凸部的孔、槽或切口。另 夕卜，也可以利用吸收油的油吸收材形成上密封部34A。
[0112] 阶梯部33是设置于油接受部32的下游侧的有高低差的部位。阶梯部33的下游 部的内径比油接受部32的内径小。阶梯部33的内壁与管20的毛细管23的下游侧的外壁 接触。通过阶梯部33的内壁与管20的外壁接触而形成下密封部34B。下密封部34B是允 许流路形成部35的油向油接受空间32A流入，同时又妨碍该流动的密封。由于在下密封部 34B的压力损失，流路形成部35的压力比外部大气压高，因此即使在热循环处理时流路形 成部35的液体被加热，流路形成部35的液体也不易产生气泡。
[0113] 流路形成部35是管状的部位，成为形成液滴状的反应液47移动的流路的容器。在 流路形成部35填充有油。流路形成部35的上游侧被管20的末端封闭，管20的末端朝向 流路形成部35开口。流路形成部35的内径比管20的毛细管23的内径大，比反应液塞子 47的容量的液体成为球状时的外径大。优选流路形成部35的内壁具有水溶性的反应液47 不附着的程度的防水性。
[0114] 应予说明，流路形成部35的上游侧被外部的高温侧加热器65B加热到相对高温 (例如约95°C )，形成高温区域36A。流路形成部35的下游侧被外部的低温侧加热器65C加 热到相对低温(例如约60°C )，形成低温区域36B。PCR容器30的底35A (下游侧的端部)包 含于低温区域36B。由此，流路形成部35内的液体形成温度梯度。
[0115] 如图5A所示，在初始状态下，在PCR容器30的流路形成部35填充有油。油的界 面位于油接受空间32A的较下游侧。油接受空间32A中的油的界面的上游侧的体积比柱塞 10的密封12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大。
[0116] 如图5B所示，如果按压柱塞10,则管20内的液体被推到流路形成部35中。由于 在流路形成部35预先填充有油，其中管20内的液体被推出，所以气体不流入流路形成部 35。
[0117] 如果柱塞10被按压，首先，管20的第3油塞子48流入流路形成部35,流入部分的 油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因下密封 部34B的压力损失而导致流路形成部35的液体的压力升高。第3油塞子48从管20被推 出后，反应液塞子47从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23 的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状）的反应液47在流路形成部35的油中成为液滴 状。应予说明，由于油接受空间32A的初始状态下的油的界面上游侧的体积比柱塞10的密 封12A在管20的下注射筒22内滑动的体积大，所以油不会从油接受空间32A溢出。
[0118] <PCR 装置 50>
[0119] 图6A是PCR装置50的内部构成的立体图。图6B是PCR装置50的主要构成的 侧视图。图7是PCR装置50的框图。PCR装置50使用筒1进行核酸溶出处理和热循环处 理。
[0120] 在以下的PCR装置50的说明中，如图所示定义上下、前后、左右。即，以将PCR装 置50的基座51设成水平时的垂直方向为"上下方向"，根据重力方向定义"上"和"下"。另 夕卜，使筒1的旋转轴的轴向为"左右方向"，与上下方向和左右方向垂直的方向为"前后方 向"。从筒1的旋转轴观察，以筒插入口 53A-侧为"后"，相反侧为"前"。从前侧观察时的 左右方向的右侧为"右"，左侧为"左"。
[0121] PCR装置50具有旋转机构60、磁铁移动机构70、按压机构80、荧光测定器55以及 控制器90。
[0122] (1)旋转机构60
[0123] 旋转机构60是使筒1和加热器旋转的机构。旋转机构60通过使筒1和加热器上 下翻转，从而液滴状的反应液47在PCR容器30的流路形成部35内移动，进行热循环处理。
[0124] 旋转机构60具有旋转体61和旋转用马达66。图8A是旋转体61的说明图。图 8B是在旋转体61的安装部62安装有筒1的状态的说明图。
[0125] 旋转体61是能够以旋转轴为中心旋转的部件。旋转体61的旋转轴被固定于基座 51的支撑台52而被支撑。在旋转体61设有安装筒1的安装部62和加热器(溶出用加热器 65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)。旋转体61旋转时，能够在维持筒1和加热 器的位置关系的状态下使筒1上下翻转。旋转用马达66是使旋转体61旋转的动力源。旋 转用马达66根据来自控制器90的指示使旋转体61旋转到规定的位置。在旋转用马达66 与旋转体61之间也可以夹设齿轮等传递机构。
[0126] 应予说明，旋转体61的旋转轴位于比筒1的PCR容器30更接近管20的位置。换 言之，旋转体61的旋转轴的高度位于安装于安装部62的筒1的管20的高度。这是由于管 20比PCR容器30长，所以假设以PCR容器30的中心为旋转轴(假设旋转体61的旋转轴的 高度位于PCR容器的高度)，则旋转体61会变得大型化。
[0127] 安装部62是安装筒1的部位。安装部62具有形成有缺口的固定部63。另外，在 加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)形成的插入孔64A也 作为安装部62发挥功能。通过在PCR容器30插入到插入孔64A的状态下，筒1的固定爪 25卡在固定部63的缺口，从而将筒1安装于旋转体61 (参照图4)。在此，加热器的一部分 兼作安装部62,但安装部62和加热器可以是各自独立的。另外，安装部62介由溶出用加热 器65A被间接地固定于旋转体61，也可以直接设置于旋转体61。另外，安装部62可安装的 筒1的个数不限于1个，也可以是多个。
[0128] 应予说明，安装部62的固定部63作为固定筒1的管20的管固定部发挥功能，插 入孔64A作为固定PCR容器30的PCR容器固定部发挥功能。这样，由管20和PCR容器30 构成的长条的筒1稳定固定于安装部62。
[0129] 在固定部63沿上下方向形成有导轨63A (参照图4)。导轨63A在前后方向限制 筒1的导板26的同时将其在插入方向上引导。导板26被导轨63A引导，同时筒1插入安 装部62,因此筒1的PCR容器30被引导到插入孔64A，筒1相对于安装部62被固定在正常 的位置。
[0130] PCR装置50具备溶出用加热器65A、作为PCR用加热器的高温侧加热器65B以及 低温侧加热器65C。各加热器由未图示的发热源和加热块构成。发热源例如是筒加热器，插 入于加热块。加热块例如是导热系数高的铝等金属，抑制热不均，用来自发热源的热将筒1 内的液体加热。另外，为了不吸附使磁珠7移动的磁铁71，优选加热块是非磁性体。
[0131] 溶出用加热器65A是对筒1的反应液塞子47进行加热的加热器。如果筒1固定 在正常的位置，则溶出用加热器65A与管20的反应液塞子47相对。例如，通过溶出用加热 器65A将反应液塞子47加热到约50°C，从而促进核酸从磁珠游离。
[0132] 高温侧加热器65B是对PCR容器30的流路形成部35的上游侧进行加热的加热器。 如果筒1被固定在正常的位置，则高温侧加热器65B与PCR容器30的流路形成部35的上 游侧（高温区域36A)相对。例如，高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上 游侧的液体加热到约90?100°C。
[0133] 低温侧加热器65C是对PCR容器30的流路形成部35的底35A进行加热的加热器。 如果筒1被固定在正常的位置，则低温侧加热器65C与PCR容器30的流路形成部35的下 游侧(低温区域36B)相对。例如，低温侧加热器65C将PCR容器30的低温区域36B的液体 加热到约50?75°C。
[0134] 在高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间配置有隔离件65D。隔离件6?抑 制高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的热传导。另外，隔离件65D也用于准确地 规定高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的距离。这样，利用高温侧加热器65B和 低温侧加热器65C在PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。
[0135] 在分别构成溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C的加热块 上分别形成有构成插入孔64A的贯通孔。PCR容器30的底35A的外壁从低温侧加热器65C 的插入孔64A的下侧开口露出。荧光测定器55从插入孔64A的下侧的开口测定反应液47 的亮度。
[0136] 应予说明，可以在高温侧加热器65B和低温侧加热器65C分别设置温度控制装置， 分别设定成适合各自的聚合酶反应的温度。
[0137] (2 )磁铁移动机构70
[0138] 磁铁移动机构70是使磁铁71移动的机构。磁铁移动机构70使磁铁71吸引筒1 内的磁珠7的同时移动磁铁71而使磁珠7在筒1内移动。磁铁移动机构70具有一对磁铁 71、升降机构73以及摆动机构75。
[0139] 磁铁71是吸引磁珠7的部件。作为磁铁71，可以使用永磁铁、电磁铁等，这里使用 不产生发热等的永磁铁。一对磁铁71以在前后方向相对并且上下方向的位置大致相同的 方式被臂72保持。各磁铁71可以从安装于安装部62的筒1的前侧或后侧相对。一对磁 铁71可以从前后方向夹着安装于安装部62的筒1。通过使磁铁71从与筒1的固定爪25 或导板26的设置方向（这里为左右方向）正交的方向（这里为前后方向）相对，从而能够使 筒1内的磁珠7与磁铁71的距离接近。
[0140] 升降机构73是使磁铁71在上下方向移动的机构。由于磁铁71吸引磁珠7,所以 如果配合磁珠7的移动而使磁铁71在上下方向移动，则能够在上下方向引导筒1内的磁珠 7。
[0141] 升降机构73具有在上下方向移动的托架73A和升降用马达73B。托架73A是可 在上下方向移动的部件，在上下方向被设置在存在筒插入口 53A的侧壁53上的托架导向部 73C可移动地引导。由于在托架73A安装了保持一对磁铁71的臂72,所以如果托架73A在 上下方向移动，则磁铁71也在上下方向移动。升降用马达73B是使托架73A在上下方向移 动的动力源。升降用马达73B根据来自控制器90的指示使托架73A移动到上下方向的规 定的位置。升降用马达73B利用带73D和滑轮73E使托架73A在上下方向移动，但也可以 利用其它传递机构使托架73A在上下方向移动。
[0142] 托架73A位于最上方的位置(退避位置)时，磁铁71位于筒1的上侧。托架73A位 于退避位置时，即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。另外，升降机构73能够将托 架73A的位置下降到磁铁71与反应塞子相对的位置。由此，升降机构73能够以使罐3内 的磁珠7移动到反应塞子的位置的方式来移动磁铁71。
[0143] 摆动机构75是使一对磁铁71在前后方向摆动的机构。如果一对磁铁71在前后 方向摆动，则各磁铁71与筒1的间隔相互不同地变化。由于磁珠7被距离近的磁铁71吸 弓丨，所以通过使一对磁铁71在前后方向摆动，从而使筒1内的磁珠7在前后方向移动。
[0144] 摆动机构75具有摆动用马达75A和齿轮。摆动用马达75A和齿轮设置于托架73A， 能够与托架73A -起在上下方向移动。通过将摆动用马达75A的动力介由齿轮传递到臂 72,从而使保持磁铁71的臂72相对于托架73A以摆动旋转轴75B为中心进行旋转。为了 防止磁铁71接触筒1而损伤筒1，摆动机构75在磁铁71与筒1不接触的范围内使磁铁71 摆动。
[0145] 摆动旋转轴75B是臂72的旋转轴。摆动旋转轴75B以能够使磁铁71在前后方向 摆动的方式在左右方向平行。从右或左观察摆动旋转轴75B时，摆动旋转轴75B偏离筒1的 前侧或后侧地配置。由此，当托架73A向下移动时，能够避免品管1与臂72接触。应予说 明，只要能够使磁铁71在前后方向摆动，摆动旋转轴75B也可以是在上下方向平行的轴。
[0146] (3)按压机构80
[0147] 按压机构80是按压筒1的柱塞10的机构。通过柱塞10被按压机构80按压，从 而将筒1的反应液塞子47和油塞子推到PCR容器30中，在PCR容器30的油中形成液滴状 的反应液47。
[0148] 按压机构80具有柱塞用马达81和杆82。柱塞用马达81是使杆82移动的动力 源。杆82是对筒1的柱塞10的安装台11A进行按压的部件。不按压筒1的罐3而按压安 装台11A的原因是罐3由可膨胀且具有挠性的树脂构成。罐3不变形时，按压机构80也可 以通过按压罐3来按压柱塞10。
[0149] 杆82按压柱塞10的方向不是上下方向，而是相对于上下方向倾斜45度。因此， 利用按压机构80来按压柱塞10时，PCR装置50使旋转体61旋转45度，使筒1的长边方 向与杆82的移动方向变一致后，使杆82移动。由于杆82按压柱塞10的方向相对于上下 方向倾斜45度，所以容易以不干扰升降机构73的方式配置按压机构80。另外，由于杆82 按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以能够减小PCR装置50的上下方向的尺 寸。
[0150] (4)荧光测定器55
[0151] 荧光测定器55是测定PCR容器30的反应液47的亮度的测定器。荧光测定器55 以与筒1的PCR容器30的底35A相对的方式配置于旋转体61的下侧。荧光测定器55从 低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口对位于PCR容器30的底35A的反应液47的亮 度进行测定。应予说明，荧光测定器55优选以能够与多重PCR对应的方式检测多个波长区 域的亮度。
[0152] (5)控制器 90
[0153] 控制器90是对PCR装置50进行控制的控制部。控制器90具有例如CPU等处理 器、ROM、RAM等存储装置。在存储装置中存储有各种程序和数据。另外，存储装置提供展开 程序的区域。通过处理器执行在存储装置中存储的程序来实现各种处理。
[0154] 例如，控制器90控制旋转用马达66,使旋转体61旋转到规定的旋转位置。在旋转 机构60设有未图示的旋转位置传感器，控制器90根据旋转位置传感器的检测结果驱动?停 止旋转用马达66。
[0155] 另外，控制器90控制加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加 热器65C)，使各加热器发热。在构成加热器的加热块设有未图不的温度传感器，控制器90 根据温度传感器的检测结果控制筒加热器的开?关。
[0156] 另外，控制器90控制升降用马达73B，使磁铁71在上下方向移动。在PCR装置50 设有检测托架73A的位置的未图示的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果驱 动?停止升降用马达73B。
[0157] 另外，控制器90控制摆动用马达75A，使磁铁71在前后方向摆动。在PCR装置50 设有对保持磁铁71的臂72的位置进行检测的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检 测结果驱动?停止摆动用马达75A。
[0158] 另外，控制器90控制荧光测定器55,测定PCR容器30的反应液47的亮度。控制 器90在荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对时，使荧光测定器55进行测定。 测定结果保存于存储装置。
[0159] <动作说明>
[0160] (1)筒1的安装动作
[0161] 图9A?图9D是筒1安装时的PCR装置50的状态的说明图。图9A是筒1安装前 的初始状态的说明图。图9B是待机状态的说明图。图9C是刚安装完筒1后的说明图。图 9D是筒1在安装状态下的初始状态的说明图。
[0162] 如图9A所示，在筒1安装前的初始状态下，安装部62的安装方向为上下方向。在 以下的说明中，以该状态的旋转体61的旋转位置为基准（0度)，以从右观察逆时针旋转为 正方向表示旋转体61的旋转位置。
[0163] 如图9B所示，控制器90驱动旋转用马达66,使旋转体61旋转-30度。在该状态 下，操作者将筒1从筒插入口 53A插入安装部62。此时，导板26被导轨63A引导，同时筒1 被插入安装部62,因此筒1的PCR容器30被引导到安装部62的插入孔64A。操作者插入筒 1直到筒1的固定爪25卡在固定部63的缺口。由此，筒1相对于安装部62被固定在正常 的位置。假设PCR容器30未插入插入孔64A，筒1相对于安装部62位于异常的位置时，由 于筒1的固定爪25不卡在固定部63的缺口，所以操作者可以识别筒1位于异常的位置。
[0164] 如图9C所示，如果筒1相对于安装部62被固定在正常的位置，则管20的反应液 塞子47与溶出用加热器65A相对，PCR容器30的流路形成部35的上游侧（高温区域36A) 与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温 侧加热器65C相对。由于在旋转体61设有安装部62和加热器，所以即使旋转体61旋转， 筒1与加热器的位置关系也会维持原样。
[0165] 如图9D所示，筒1被安装于安装部62后，控制器90使旋转体61旋转30度，旋转 体61的位置回到基准。应予说明，控制器90可以通过未图示的传感器对筒1安装在安装 部62进行检测，也可以通过来自操作者的输入操作来检测。
[0166] (2)核酸溶出处理
[0167] ?磁铁71的上下移动
[0168] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的概念图。筒1内的磁珠7被磁 铁71吸引。因此，如果磁铁71在筒1的外部移动，则筒1内的磁珠7与磁铁71-起移动。
[0169] 图11A?图11C是核酸溶出处理的说明图。图11A是核酸溶出处理前的PCR装置 50的状态的说明图。图11B是使磁铁71移动到反应液塞子47时的PCR装置50的状态的 说明图。图11C是拉起磁铁71时的PCR装置50的状态的说明图。
[0170] 如图11A所示，初始状态的筒1使罐3在上侧，长边方向与垂直方向平行。该状态 中，如图2A所示，筒1从上依次具备包含磁珠7的溶解液41 (罐3)、油42 (柱塞10)、清洗 液43 (管20的上游侧)、第1油塞子44 (毛细管23)、清洗液塞子45 (毛细管23)、第2油 塞子46 (毛细管23)、反应液塞子47 (毛细管23)、第3油塞子48 (毛细管23)以及油（PCR 容器30)。
[0171] 如图11A所示，在初始状态下，托架73A位于最上方的位置(退避位置)，磁铁71位 于筒1的上侧。控制器90驱动升降用马达73B，使托架73A从该状态缓慢向下方移动，使磁 铁71缓慢向下方移动。应予说明，由于筒1的长边方向与垂直方向平行，所以磁铁71沿筒 1移动。
[0172] 磁铁71向下方移动，则磁铁71与罐3相对，罐3内的磁珠7被磁铁71吸引。控 制器90以磁珠7能够与磁铁71 -起移动的程度的速度使托架73A向下方移动。
[0173] 如果磁铁71从与罐3相对的位置(罐3的高度）移动到与柱塞10相对的位置(柱 塞10的高度)，则磁珠7通过柱塞10的筒状部11的上游侧的开口，并通过罐3内的溶解液 41与筒主体9的上游侧的油42的界面。由此，核酸结合的磁珠7被导入到筒主体9。磁珠 7通过溶解液41与油42的界面时，溶解液41被油42洗刷，所以溶解液41的成分不易被带 入油42。由此，能够抑制溶解液41的成分混入清洗液、反应液47。
[0174] 如果磁铁71在与柱塞10相对的状态下向下方移动，则磁珠7通过筒状部11的内 部，穿过凸缘13的表里而从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入到管20的上注射筒21。 其间，磁珠7在柱塞10内通过油42与清洗液43的界面。如果磁珠7被导入到清洗液43， 则与磁珠7结合的核酸被清洗液43清洗。
[0175] 在该阶段，由于柱塞10的棒状部12没有插入管20的下注射筒22,所以如果磁铁 71从与上注射筒21相对的位置（上注射筒21的高度）移动到与毛细管23相对的位置（毛 细管23的高度)，则磁珠7从上注射筒21向下注射筒22移动，从下注射筒22向毛细管23 移动。在毛细管23的上游侧有第1油塞子44,当磁珠7从下注射筒22向毛细管23移动 时，磁珠7通过清洗液43与油的界面。此时，由于清洗液43被油洗刷，所以清洗液43的成 分不易被带入油中。由此，能够抑制清洗液43的成分混入清洗液塞子45、反应液塞子47。
[0176] 如果磁铁71从与第1油塞子44相对的位置(第1油塞子44的高度）移动到与清 洗液塞子45相对的位置(清洗液塞子45的高度)，则磁珠7通过油与清洗液的界面。磁珠 7被导入到清洗液塞子45,则与磁珠7结合的核酸被清洗液清洗。
[0177] 如果磁铁71从与清洗液塞子45相对的位置(清洗液塞子45的高度）移动到与第 2油塞子46相对的位置(第2油塞子46的高度)，则磁珠7通过清洗液与油的界面。此时， 由于清洗液被油洗刷，所以清洗液的成分不易被带入油中。由此，能够抑制清洗液的成分混 入到反应液塞子47。
[0178] 如果磁铁71从与第2油塞子46相对的位置(第2油塞子46的高度）移动到与反 应液塞子47相对的位置(反应液塞子47的高度)，则磁珠7通过油与反应液47的界面。
[0179] 控制器90在磁珠7被导入到反应液塞子47前，控制溶出用加热器65A而预先将 反应液塞子47加热到约50°C。另外，通过在磁珠7被导入前预先加热反应液47,从而能够 缩短磁珠7被导入反应液47后到结束核酸的溶出的时间。
[0180] 如图11B所示，在磁铁71移动到与反应液塞子47相对的位置（反应液塞子47的 高度）后，控制器90停止升降用马达73B，停止磁铁71的上下方向的移动，在50°C下处理 30秒钟，则与磁珠7结合的核酸游离到反应液塞子47的溶液中，进行逆转录反应。通过加 热反应液47促进核酸从磁珠7的溶出和逆转录反应。
[0181] 使核酸在反应液塞子47溶出后，控制器90使升降用马达73B向与之前相反的方 向驱动，使托架73A缓慢向上方移动，使磁铁71缓慢向上方移动。控制器90以磁珠7能够 与磁铁71 -起移动的程度的速度使托架73A向上方移动。
[0182] 如果使磁铁71从图11B所示的状态向上方移动，则磁珠7从反应液塞子47向第 2油塞子46移动，磁珠7从反应液塞子47被除去。
[0183] 如果磁铁71缓慢移动到与上注射筒21相对的位置，则磁珠7也移动到上注射筒 21，磁珠7到达下注射筒22的上侧。如果使磁珠7移动到该位置，则按压柱塞10时磁珠7 不会被导入到PCR容器30。因此，控制器90在从该状态到图11C所示的状态期间，可以以 磁珠7无法追随磁铁71的移动的程度的速度使托架73A向上方移动。应予说明，只要按压 柱塞10时，磁珠7不被导入PCR容器30,就能够在更早的阶段加快托架73A的移动速度。
[0184] 在控制器90的存储装置存储有与磁铁71的移动速度相关的信息，控制器90根据 该信息来执行上述动作(使磁铁71上下移动的动作)。
[0185] ?磁铁71的摆动
[0186] 使磁铁71在上下方向移动期间，控制器90可以驱动摆动用马达75A，使夹着筒1 的一对磁铁71在前后方向摆动。
[0187] 图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的概念图。
[0188] 磁铁71在上下方向移动期间，管20从前后方向被一对磁铁71夹着。由于一对磁 铁71被臂72保持，所以一对磁铁71的前后方向的距离几乎恒定。因此，如果一对磁铁71 中的一方接近管20,则另一方远离管20。
[0189] 由于磁珠7被距离近的磁铁71吸引，所以如果一侧磁铁71接近管20,则磁珠7被 吸引到该磁铁71侧。然后，如果该磁铁71远离管20,相反侧的磁铁71接近管20,则这次 磁珠7被相反侧的磁铁71吸引。由此，磁珠7在前后方向移动。如果使一对磁铁71在前 后方向摆动，则磁珠7在前后方向往返移动。
[0190] 如果磁珠7在前后方向往返移动，则磁珠7容易接触液体。特别是由于毛细管23 内的液体几乎不具有流动性，所以想要使毛细管23内的液体尽量接触磁珠7时，使磁珠7 在前后方向往返移动是有效的。
[0191] 图13表不磁铁71有无摆动的表。
[0192] 磁珠7在向下方移动油塞子(第1油塞子44或第2油塞子46)时，控制器90停止 摆动马达，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在一对磁铁71中的一方接近管20的状态下， 使磁铁71向下方移动。这是因为与使各磁铁71和管20的距离相等时相比，磁珠7更容易 追随磁铁71移动。
[0193] 磁珠7在清洗液塞子45内向下方移动时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在 前后方向摆动。由此，磁珠7在清洗液塞子45内，在前后方向摆动的同时向下方移动，因此 能够提高磁珠7的清洗效率。另外，由于清洗效率的提高，所以能够抑制清洗液塞子45的 量，能够实现筒1的小型化。
[0194] 当磁珠7通过清洗液与油(第2油塞子46)的界面时，控制器90停止摆动马达，不 使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，因此清洗液的成分不易被带入油中。应 予说明，控制器90在一对磁铁71中的一方接近管20的状态下，使磁铁71向下方移动。由 此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而凝聚，附着于磁珠7的清洗液会聚，因此清洗液的成分 不易被带入油中。
[0195] 当磁珠7在反应液塞子47时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆 动。由此，磁珠7在反应液塞子47内在前后方向摆动，所以能够提高与磁珠7结合的核酸 的溶出效率。另外，由于溶出效率的提高，所以能够缩短从磁珠7被导入反应液47后到结 束核酸的溶出的时间。
[0196] 应予说明，使核酸在反应液塞子47溶出后，使磁铁71向上方移动而拉起磁珠7 时，控制器90停止使摆动马达，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在使一对磁铁71中的 一方接近管20的状态下，使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7变得容易追随磁铁71的移 动，能够加快磁铁71的移动速度。
[0197] 在控制器90的存储装置中存储有与毛细管23的各塞子的位置相关的信息和如图 13所示的摆动信息，控制器90根据该信息执行上述动作(使磁铁71摆动的动作)。
[0198] (3)液滴形成处理
[0199] 图14A?图14C是液滴形成处理的说明图。图14A是拉起磁铁71时的PCR装置 50的状态的说明图。图14B是使旋转体61旋转45度的状态的说明图。图14C是按压机构 80的杆82按压柱塞10的状态的说明图。
[0200] 如图14A所示，托架73A位于退避位置时，即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1 接触。成为这样的状态之后，控制器90使旋转体61旋转45度。
[0201] 如图14B所示，如果旋转体61旋转45度，则筒1的长边方向与按压机构80的杆 82的移动方向平行。控制器90驱动柱塞用马达81，使杆82移动。如果杆82与筒1的柱 塞10的安装台11A接触之后进而杆82移动，则柱塞10被压入管20侧。控制器90使杆82 移动到图14C所示的状态，按压柱塞10直到柱塞10的安装台11A接触管20的上缘。
[0202] 如果柱塞10被压入到管20侧，则柱塞10的棒状部12的密封12A嵌合于管20的 下注射筒22 (参照图2B)。并且，如果进一步压入柱塞10,则密封12A在下注射筒22内滑 动。这样，与密封12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20的下游侧的液体(第3油塞 子48、反应液塞子47等）被推到PCR容器30的流路形成部35。
[0203] 首先，管20的第3油塞子48流入流路形成部35。由于在流路形成部35填充有 油，所以流入部分的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上 升。此时，因在下密封部34B的压力损失而引起流路形成部35的液体的压力比外部大气压 (油接受空间32A的压力）高。第3油塞子48从管20被推出后，反应液塞子47从管20流 入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子 状的反应液47在流路形成部35的油中成为液滴状。
[0204] 由于密封12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体从下游侧被推出的量） 比管20内的反应液塞子47和第3油塞子48的总量大，所以反应液塞子47从管20被推出 后，第2油塞子46的一部分也被推到流路形成部35。由此，反应液47不残留在管20,反 应液塞子47的溶液量全部成为液滴状。另外，因为第2油塞子46的一部分从管20的下游 侧被推出，所以液滴状的反应液47容易从管20分离（液滴状的反应液47不易吸附于毛细 管23的开口）。
[0205] 由于毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径）被设计成较小，所以在PCR容 器30内液滴化的反应液47不易吸附于毛细管23的开口。另外，反应液47的比重比PCR 容器30的油大。因此，液滴状的反应液47从毛细管23的末端脱离后，以流路形成部35为 流路朝向底35A沉降。但是，由于在该阶段，流路形成部35的流路倾斜45度，所以液滴状 的反应液47容易附着于流路形成部35的内壁。因此，需要将流路形成部35的流路返回到 铅直方向。
[0206] 在形成了液滴状的反应液47后（按压柱塞10后)，控制器90使柱塞用马达81向 与之前相反的方向驱动，使杆82回到原来的位置。在该状态下，即使筒1旋转，按压机构80 的杆82也不与筒1接触。成为这样的状态之后，控制器90使旋转体61返回基准位置。当 旋转体61回到基准位置时，流路形成部35的流路为铅直方向，因此液滴状的反应液47不 易附着于流路形成部35的内壁。
[0207] (4)热循环处理
[0208] 图15A和图15B是热循环处理的说明图。图15A是对反应液47实施低温侧的温度 处理的状态的说明图。图15B是对反应液47实施高温侧的温度处理的状态的说明图。在 各图的左侧示出了 PCR装置50的状态，在各图的右侧示出了 PCR容器30的流路形成部35 的内部的状态。
[0209] 如果筒1相对于安装部62固定在正常的位置，则PCR容器30的流路形成部35的 上游侧（高温区域36A)与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧 (低温区域36B)与低温侧加热器65C相对。热循环处理期间，控制器90利用设置于旋转体 61的高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的高温区域36A的液体加 热到约90?100°C。另外，控制器90利用设置于旋转体61的低温侧加热器65C将流路形 成部35的下游侧的低温区域36B的液体加热到约50?75°C。由此，热循环处理期间，PCR 容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。由于在旋转体61设有安装部62和加热 器，所以即使旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持原样。
[0210] 热循环处理期间，PCR容器30内的液体被加热。假设PCR容器30的液体因被加 热而产生气泡，则流路形成部35内的液体的温度可能会发生不均或流路形成部35中的液 滴状的反应液47的移动(沉降）受到阻碍等。但是，在本实施方式中，由于在下密封部34B 的压力损失而导致流路形成部35的液体的压力比外部大气压高，所以PCR容器30的液体 不易产生气泡。
[0211] 如图15A所示，旋转体61位于基准位置时，低温侧加热器65C位于高温侧加热器 65B的下侧，筒1的PCR容器30的底35A成为下方。由于液滴状的反应液47的比重比油 大，所以液滴状的反应液47在流路形成部35内沉降。液滴状的反应液47在流路形成部35 内沉降，到达PCR容器30的底35A，进而结束沉降而停留在低温区域36B。由此，液滴状的 反应液47向低温区域36B移动。控制器90以规定时间保持图15A的状态，将液滴状的反 应液47在低温区域36B加热到约50?75°C (实施低温侧的温度处理)。其间，引发聚合酶 反应的延伸反应。
[0212] 如果控制器90驱动旋转用马达66使旋转体61从图15A的状态旋转180度，则成 为图15B所示的状态。如果旋转体61从基准位置旋转180度，则筒1上下翻转，同时高温 侧加热器65B和低温侧加热器65C也上下翻转。换言之，高温侧加热器65B位于低温侧加 热器65C的下侧，筒1的PCR容器30的底35A成为上方。液滴状的反应液47在流路形成 部35内沉降，到达管20的末端（毛细管23的末端)，进而结束沉降而停留在高温区域36A。 由此，液滴状的反应液47向高温区域36A移动。控制器90以规定时间保持图15B的状态， 将液滴状的反应液47在高温区域36A加热到约90?100°C (实施高温侧的温度处理)。其 间，引起聚合酶反应的变性反应。
[0213] 如果控制器90驱动旋转用马达66使旋转体61从图15B的状态旋转-180度，则 返回图15A的状态。在该状态下，液滴状的反应液47在流路形成部35内沉降，液滴状的反 应液47向低温区域36B移动，在低温区域36B再次被加热到约50?75°C (实施低温侧的 温度处理)。应予说明，由于毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)被设计成较小， 所以反应液47不易吸附于毛细管23的开口，因此旋转体61从图15B的状态旋转-180度 时，液滴状的反应液47不吸附于毛细管23的开口，从管20分离朝向PCR容器30的底35A 沉降。
[0214] 控制器90驱动旋转用马达66,以规定循环数反复使旋转体61的旋转位置为图 15A的状态和图15B的状态。由此，PCR装置50能够对反应液47实施PCR的热循环处理。
[0215] 在控制器90的存储装置存储有高温侧加热器65B的温度、低温侧加热器65C的温 度、在图15A的状态下保持的时间、在图15B的状态下保持的时间、循环数（图15A的状态和 图15B的状态的反复次数）的热循环信息，控制器90根据该热循环信息执行上述处理。
[0216] (5)荧光测定
[0217] 如图15A所示，旋转体61位于基准位置时，荧光测定器55与筒1的PCR容器30 的底35A相对。因此，在反应液47的荧光测定时，控制器90在使旋转体61为基准位置的 状态下，用荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口对位于PCR容器30 的底35A的反应液47的荧光强度进行测定。
[0218] 在旋转体61旋转180度而刚成为基准位置之后，液滴状的反应液47在PCR容器 30的流路形成部35沉降，液滴状的反应液47有时还未到达PCR容器30的底35A。因此， 优选控制器90在旋转体61的旋转位置成为图15A的状态之后，经过规定时间后(使旋转体 61从图15A的状态旋转之前)，测定荧光强度。或者也可以是控制器90在从旋转体61到基 准位置后的规定时间的期间，使荧光测定器55测定荧光强度，存储荧光强度的时间历程。
[0219] < 小结 >
[0220] 如上所述，作为核酸扩增反应装置的PCR装置50具备：具有安装筒1的安装部（固 定部63和插入孔64A)的旋转体61和在作为核酸扩增反应容器的PCR容器30的内部形成 温度梯度的PCR用加热器(高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)。安装于旋转体61的 筒1具备：具有含有溶出液的反应液塞子47的管20和含有油的PCR容器30。进而，对于 PCR装置50,通过使旋转体61旋转而改变筒1的姿势，从而使从管20导入的液滴状的反应 液47在PCR容器30的内部移动。这样，由于PCR容器30的姿势能够与进行核酸溶出处理 的管20 -起变化而进行聚合酶反应，所以能够缩短处理时间。
[0221] 根据上述PCR装置50,旋转体61的旋转轴位于筒1的比PCR容器30更接近管20 的位置。这样，能够使旋转体61小型化。应予说明，由于管20比PCR容器30长，所以假设 以PCR容器30的中心为旋转轴，则旋转体61会变得大型化。
[0222] 固定筒1的管20的固定部63和固定PCR容器30的插入孔64A作为将筒安装于旋 转体的安装部发挥功能。这样，由管20和PCR容器30构成的长条的筒1被稳定地固定。
[0223] 在上述的PCR装置50中，PCR用加热器(高温侧加热器65B和低温侧加热器65C) 设置于旋转体61。这样，无论旋转体61的旋转位置如何，均维持筒1的PCR容器30与PCR 用加热器的位置关系，形成于PCR容器的内部的温度梯度变稳定。
[0224] 另外，在上述的PCR装置50中设有溶出用加热器65A。由此，促进核酸从磁珠游 离。
[0225] 上述的PCR装置50具有使磁铁71沿管20移动的磁铁移动机构70(升降机构73)。 这样，能够使作为核酸结合性固相载体的磁珠的移动自动化，能够每次同样地移动磁珠。
[0226] 另外，上述的磁铁移动机构70具有摆动机构75。这样，能够在管20的内部调整磁 珠的凝聚?扩散，能够提高清洗效率、溶出效率等，能够缩短处理时间。
[0227] 另外，上述的PCR装置50具有按压筒1的柱塞10的按压机构80。这样，能够使从 管20向PCR容器30导入使核酸溶出的反应液塞子47的处理自动化。
[0228] 第2实施方式
[0229] 第2实施方式是将与第1实施方式不同的构成的筒1安装于PCR装置50。
[0230] <筒 1 >
[0231] 图16A和图16B是第2实施方式的筒1的说明图。图17A是第2实施方式的筒1 的初始状态的说明图。图17B是从图17A的状态按压柱塞10,密封12A接触下注射筒22时 的侧视图。图17C是按压柱塞10后的第2实施方式的筒1的说明图。应予说明，第2实施 方式的筒1的管20具备溶出液塞子47A、油塞子47B以及核酸扩增反应液塞子47C来代替 第1实施方式的反应液塞子47。油塞子47B防止作为其两侧的水溶性塞子的溶出液塞子 47A与核酸扩增反应液塞子47C相互混和。
[0232] 筒1是进行使核酸从核酸结合的磁珠7溶出的核酸溶出处理的容器，并且是对作 为溶出液47A和核酸扩增反应液塞子47C的混合液的PCR溶液进行用于聚合酶反应的热循 环处理的容器。
[0233] 筒1的罐3和筒主体9的形状与第1实施方式相同。另外，筒1的罐3的溶解液 41也与第1实施方式相同。另外，筒主体9的油42、第1清洗液43、第1油塞子44、清洗液 塞子45 (第2清洗液）以及第2油塞子46也与第1实施方式相同。因此，省略这些说明。
[0234] 溶出液塞子47A和核酸扩增反应液塞子47C例如由以下反应液构成。
[0235]

【权利要求】
1. 一种核酸扩增反应装置，其特征在于，具备： 具有安装部的旋转体，其中，所述安装部上安装筒，所述筒具备管和核酸扩增反应容 器，所述管具有含有使所述核酸从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出的溶出液的塞 子，所述核酸扩增反应容器与所述管连通且含有与所述溶出液相分离的油；和 在所述核酸扩增反应容器的内部形成温度梯度的加热器； 并且，通过使所述旋转体旋转而改变所述筒的姿势，从而使含有从所述管导入的所述 溶出液的液滴，在所述核酸扩增反应容器的内部移动。
2. 根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，所述旋转体的旋转轴位于 与所述核酸扩增反应容器相比更靠近所述管侧。
3. 根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，所述安装部具有固定所 述管的管固定部和固定所述核酸扩增反应容器的容器固定部。
4. 根据权利要求1?3中任一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，所述加热器设 置于所述旋转体。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，设有对安装于 所述安装部的所述筒的所述塞子进行加热的溶出用加热器。
6. 根据权利要求1?5中任一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，进一步具有使 磁铁沿所述管移动的磁铁移动机构。
7. 根据权利要求6所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，所述磁铁移动机构使所述 磁铁摆动而改变所述磁铁与所述管的距离。
8. 根据权利要求1?7中任一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，进一步具有用 于使液体从所述管向所述核酸扩增反应容器推出而按压设置于所述筒的柱塞的按压机构。
9. 一种核酸扩增方法，其特征在于， 将具备管和核酸扩增反应容器的筒安装于安装部，其中，所述管具有含有使所述核酸 从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出的溶出液的塞子，所述核酸扩增反应容器与所述 管连通且含有与所述溶出液相分离的油， 在所述核酸扩增反应容器的内部形成温度梯度，并且，进行通过使具有所述安装部的 旋转体旋转而改变所述筒的姿势，从而使含有从所述管导入的所述溶出液的液滴，在所述 核酸扩增反应容器的内部移动。
【文档编号】C12N15/10GK104046556SQ201410089864
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】小枝周史, 高城富美男 申请人:精工爱普生株式会社