转基因玉米mir604结构特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米MIR604结构特异定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列MIR604ConF、下游引物序列MIR604ConR、荧光探针序列MIR604ConP、MIR604品系的DNA稀释液以及Taqman?Master?mix（2×）和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因MIR604品系生物成分检测。
【专利说明】转基因玉米MIR604结构特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技术】
[0002]国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米MIR604结构特异定量PCR精准检测方法已成为必要。
[0003]目前关于转基因玉米MIR604的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法和标准，尚无关于扩增检测转基因玉米MIR604及产品的结构特异性某特定位点(基因序列)的定量PCR精准检测技术。
【发明内容】
[0004]本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604及产品的结构特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
[0005]本发明通过下述技术方案实现:
转基因玉米MIR604结构特异定量PCR精准检测的引物和探针，
上游引物序列，MIR604ConF:5’ -GACGACTTGTTTCATTGATTCTTCA-3’ ；
下游引物序列，MIR604ConR:5’- GGGCCTCGGTGTTGTTGTC -3’ ；
荧光探针序列，MIR604ConP:5’ -FAM-ATCGAGCTTCTITTGCACCA-TAMRA-3’。
[0006]转基因玉米MIR604结构特异性定量PCR精准检测方法，包括以下步骤:
(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，MIR604ConF:5’ -GACGACTTGTTTCATTGATTCTTCA-3’
下游引物序列，MIR604ConR:5’- GGGCCTCGGTGTTGTTGTC -3’
荧光探针序列，MIR604ConP:5’ -FAM-ATCGAGCTTCTITTGCACCA-TAMRA-3’ ；
(2)制备MIR604品系的DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)定量PCR检测。
[0007]进一步地，步骤(1)所述合成的引物及荧光探针的浓度均为lOMfflol/l，步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/^l。
[0008]再进一步地，步骤(3)所述的配制PCR反应体系，即将4μ1的DNA稀释液加入到2θμL反应体系中，所述2θμL的反应体系包括以下组分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL
下游引物ιμL
【权利要求】
1.转基因玉米MIR604结构特异性定量PCR精准检测的引物和探针，其特征在于， 上游引物序列，MIR604ConF:5’ -GACGACTTGTTTCATTGATTCTTCA-3’ ； 下游引物序列，MIR604ConR:5’- GGGCCTCGGTGTTGTTGTC -3’ ； 荧光探针序列，MIR604ConP:5’ -FAM-ATCGAGCTTCTITTGCACCA-TAMRA-3’。
2.转基因玉米MIR604结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列，MIR604ConF:5’ -GACGACTTGTTTCATTGATTCTTCA-3’ 下游引物序列，MIR604ConR:5’- GGGCCTCGGTGTTGTTGTC -3’ 荧光探针序列，MIR604ConP:5’-FAM-ATCGAGCTTCTITTGCACCA-TAMRA-3’ ； (2)制备MIR604品系的DNA稀释液； (3)配制PCR反应体系； (4)定 量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米MIR604结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤(1)所述合成的引物及荧光探针的浓度均为lOMfflol/l，步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/^l。
4.根据权利要求3所述的转基因玉米MIR604结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的配制PCR反应体系，即将4μ1的DNA稀释液加入到20μ1反应体系中，所述20μ1的反应体系包括以下组分: Taqman Master mix (2X )10M-1上游引物ιμL下游引物ιμL荧光探针0.5μ1 DNA稀释液4.ΟμL水3.5μ1。
5.根据权利要求2或4所述的转基因玉米MIR604结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为:95°C预变性10min，l个循环；95°C变性15s，59°C退火60s, 45个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103937878SQ201410092200
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】常丽娟, 宋君, 雷绍荣, 郭灵安, 刘勇, 王东, 尹全, 张富丽, 刘文娟 申请人:四川省农业科学院分析测试中心