日照海蝉的dna条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法
【专利摘要】日照海蝉的DNA条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法，涉及物种鉴定【技术领域】，特别涉及日照海蝉的DNA条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法。所述DNA条形码标准基因为COI基因，具有如SEQIDNO.1所示的基因序列。所述的鉴定方法是：从待测组织中分离提取DNA，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因，扩增反应中所使用的一对引物的序列如下：正向引物5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，反向引物5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。本发明获得的基因序列有利于实现日照海蝉的分子鉴定，能有效缩短日照海蝉的鉴定时间。
【专利说明】日照海蝉的DNA条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及物种鉴定【技术领域】，特别涉及日照海蝉的DNA条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法。
【背景技术】
[0002]日照海蝉，是日照当地俗称为“海知了”的一种生物，其形似陆上幼蝉，学名为解放眉足蟹，又称海蝉蟹，是一种介于虾和蟹之间的海洋甲壳动物。在中国大陆沿海，仅产于山东日照沿海一带，为正宗日照特产。海蝉蟹经煎炒后，入口香脆，鲜美异常，其肉质味美媲美龙虾，富含钙磷钾等矿物质，营养丰富。近年来由于解放眉足蟹被作为海鲜特色菜端上餐桌，消费者对解放眉足蟹的需求量大大增加，从而导致了其采挖量的随之增高；加之沿海污染物的排放破坏了其生存环境，严重影响了解放眉足蟹的繁殖成活率；所以解放眉足蟹的生存数量一直处于下降的趋势。因此，对日照海蝉地方特有物种进行抢救性收集、保护已刻不容缓。
[0003]DNA条形码(DNA barcoding)是一段标准的，能快速、高效鉴定物种的DNA序列。这个概念的产生是受在零售业中条形码技术应用的启发。DNA条形码技术就像在零售业中广泛运用的商品条形码一样，通过对一个生物实体的一个或多个基因进行扫描，来鉴定物种和发现新种，以期建立起DNA序列和生物物种之间一一对应的关系。随着分子生物技术和计算机技术的发展，DNA条形码一这种新兴的技术己经得到了许多领域的越来越多的科学家的关注，利用DNA条形码发现新物种或隐存种，鉴定濒危物种和鉴别外来入侵种的工作方兴未艾 ，并为保护生物多样性作出了巨大的贡献。
[0004]物种识别鉴定是认识自然的第一步，也是分类学乃至几乎所有的生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，正确认识和区分物种，特别是对那些具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。海洋生物占据着全球物种量中的很大一部分，目前己被发现的海洋生物约有21万种，对如此庞大的海洋生物群体进行分类是一项非常艰巨的工作。自2003年Hebert对DNA条形码开展研究以来，越来越多的研究表明DNA条形码在物种分类上具有高效可行性。近几年，DNA条形码技术己被应用到海洋生物的分类研究中。
[0005]相对于其他海洋生物，DNA条形码技术在鱼类分类研究和应用更为广泛。目前己获得5000多种鱼类的DNA条形码序列，其中多数为海洋鱼类，并建立了专门的鱼类条形码数据库，计划获得全球1.5万多种海洋鱼类的条形码数据，每个物种至少5条记录。在其他海洋生物中，DNA条形码研究也已经逐渐开展。刘君等研究了 DNA条形码技术在贻贝科种类鉴定中的应用，王鹤等研究了中国近海习见头足类DNA条形码及其分子系统进化，梁华芳等对中国沿海龙虾属8种龙虾COI基因DNA条形码的分子系统学研究，王琳楠等对中国帘蛤目主要经济贝类的分子系统发育进行了研究，结果表明，线粒体COI基因作为帘蛤目贝类条形码在物种鉴定的适用性上提供了一定的依据，同时也为形态分类系统提供了必要补充。[0006]大量的研究结果都显示以CO 基因为标记的DNA条形码能够准确对海洋生物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各海洋生物条形码数据库的标准条形码。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且有利于实现快速鉴定。目前，Genbank中已有部分蝉蟹的COI基因序列，但至今尚无日照海蝉的相关基因序列。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种日照海蝉的DNA条形码标准基因序列，以实现日照海蝉的快速鉴定。
[0008]本发明提供的日照海蝉的DNA条形码标准基因序列，其特征在于:所述DNA条形码标准基因为COI基因，具有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
[0009]本发明还提供了一种日照海蝉的物种鉴定方法，其特征在于包括以下步骤:
1)从待测组织中分离提取DNA;
2)以步骤I)提取到的DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因，扩增反应中所使用的一对引物的序列如下:
正向引物 5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，
反向引物 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ；
3)取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的目的基因用琼脂糖电泳分离，经嗅乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出709 bp的条带，则送生物公司测序；
4)根据测序结果，如果与如SEQID N0.1所示的基因序列的同源性在98%以上，即可判断该待测组织即为日照海蝉。
[0010]有益效果:
与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现日照海蝉的分子鉴定，能有效缩短日照海蝉的鉴定时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明的技术流程图；
图2是待测样本PCR扩增后获得的目的基因的电泳鉴定图，编号说明如下:泳道1-6均为目的基因，检出大小为709 bp的条带，M为DL2000的DNA marker。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
[0013]实施例1
1、待测样本的采集保存与处理
在鲁南海滨森林公园(日照大沙洼)海边采集待测样本，取一部分肌肉组织，然后将样品保存于95%酒精或-20°c的冰柜中。
[0014]2、DNA模板制备
酚-氯仿方法提取样品中的DNA，于_20°C保存备用。[0015]3、引物合成
正向引物:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
反向引物:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，
4、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表1所示。
[0016]表1为待测样本目的基因PCR反应体系(50uL体系)
【权利要求】
1.日照海蝉的DNA条形码标准基因序列，其特征在于:所述DNA条形码标准基因为COI基因，具有如SEQ ID N0.1所示的基因序列。
2.一种日照海蝉的物种鉴定方法，其特征在于包括以下步骤: 1)从待测组织中分离提取DNA; 2)以步骤1)提取到的DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增出目的基因，扩增反应中所使用的一对引物的序列如下:
正向引物 5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’， 反向引物 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ； 3)取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的目的基因用琼脂糖电泳分离，经嗅乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出709 bp的条带，则送生物公司测序； 4)根据测序结果，如果与如SEQID N0.1所示的基因序列的同源性在98%以上，即可判断该待测组织即为日照海蝉。
【文档编号】C12Q1/68GK103937802SQ201410100160
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】刘丰铭 申请人:刘丰铭