一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒及其制备和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种无创幽门螺杆菌基因检测的引物、试剂盒及其制备与检测方法，该试剂盒包括特异引物，采用步骤简单的PCR扩增方法，通过对样品进行无创采集制作，减轻病人在检测过程中的痛苦。本发明克服了现有技术的不足，提供一种简单、快速、灵敏的无创幽门螺杆菌的检测试剂盒及制备与检测方法，该方法步骤简单，是灵敏检测幽门螺杆菌的试剂盒，避免了使用胃镜等有创取样，一方面能降低病人检测中的痛苦，另一方面大大降低了时间、人力物力成本。
【专利说明】一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒及其制备和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种无创幽门螺杆菌基因检测的引物、试剂盒及其制备和检测方法，具体设计一种引物，配置成一个试剂盒，提供一种无创、简单、快速、灵敏的幽门螺杆菌基因检测的试剂盒及检测方法，为检测人和动物幽门螺杆菌感染提供方法和试剂。
【背景技术】[0002]1983年幽门螺旋杆菌{Helicobacter pylori简称Hp)被澳大利亚的Warren和Warshail发现，已被确认为最常见的慢性感染性疾病的病原之一。现阶段临床检测Hp主要分为侵入性和非侵入性两大类，侵入性检测一般为胃镜检测和血清抗体检测；非侵入性检测为同位素C标记呼吸实验和粪幽门螺杆菌抗原检测。这些检测方法虽为临床常规检测方法，但上述方法都不定量，同时检测不方便，更重要的是因敏感性不高，检测结果不能及时反映幽门螺杆菌的感染状况。另外，这些检测需要采血或下胃镜取胃组织，或口服放射性标记物，对人体或环境有一定的伤害。多聚酶链式式反应(PCR)技术的出现，大大提高了检测的灵敏度和准确性，理论上，只要样本中有I个被检物质的基因，就可以用PCR检测方法检测出来。PCR方法是分子诊断的一种典型的诊断方法，其具有检测灵敏度高，取材方便，检测高通量等优点。大量研究显示。幽门螺杆菌进入和排出人或动物体的唯一途径是粪-口，因此在疑似幽门螺杆菌感染者的粪便样本和口腔样本中一定含有幽门螺杆菌核酸分子，用特异的PCR引物，通过适当的试剂配制，可以用PCR技术无创伤的从唾液或粪便样本中快速检测幽门螺杆菌的感染，这种新型的检测方法对诊断幽门螺杆菌有着非常重要的意义。
[0003]目前，已有的Hp检测方法通常为侵入性的，如组织切片染色检查是取胃粘膜标本切片或者涂片染色镜检查Hp，再如组织切片免疫组织化学染色检查是将组织切面的免疫组织化学染色对Hp进行检测，且一般不能作为常规的诊断手段，这些检测的介质都需要经过复杂的采集制作过程，比如为提取DNA需要裂解液而对人的胃造成一定的损伤，这样就会对人力物力和检测时间都不具有成本节约性。
【发明内容】
[0004]本发明克服了临床现有幽门螺杆菌检测技术的不足，提供一种无创、简单、快速、灵敏的幽门螺杆菌基因检测引物及试剂盒制备和检测方法。该试剂盒制备方法和操作步骤简单，采用唾液或粪便为检测样本，无需特殊处理，可快速、定性和定量检测幽门螺杆菌的感染状况。取唾液或粪便样本无创、方便；用特异引物PCR扩增灵敏度高，特异性好；用特殊的反应条件，无需繁杂的操作过程，降低病人检测中的痛苦，提高了检测的灵敏度和特异性，。
[0005]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
设计筛选了一种特异地用于无创幽门螺杆菌基因检测的引物，所述引物为5’-TTGGGATAGCCATTGGAAACG _3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 。[0006]建立了该引物的扩增方法，包括以下两个步骤:
a、熔链:在92-96°C下进行8_10s；
b、退火延伸:在56-66°C下进行25-30S，退火延伸是在同一个温度条件下进行的，因此不需要将熔炼后的产物经过2次降温，而直接将产物降温到延伸时需要的温度，省去了一次降温步骤，而节约了操作工序和操作时间，同时节约了成本；
该两个步骤按顺序循环30cycle。
[0007]退火温度为62°C。
[0008]一种用于无创幽门螺杆菌基因检测的试剂盒，包括所述的引物(Rl)，还包括R2试剂、R3试剂，所述R2试剂为PCR Taq酶预混合液(如=TAKARA的SYBR Green Taq MIX等)，所述R3试剂为无菌蒸馏水。
[0009]该无创幽门螺杆菌基因检测的试剂盒配置和操作包括以下步骤:
(O无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒配制:引物Rl用无菌蒸馏水稀释到终浓度8-10 μ M，SYBR Green Taq MIX为R2试剂；灭菌的蒸馏水作为R3试剂)。将所述试剂组分别包装或预混合包装，如PCR扩增管分别预装Rl或R2或R3，配置成试剂盒，又如PCR扩增管预装Rl、R2和R3的混合物。
[0010](2)PCR模板:可取粪便样品或口腔样本，水煮沸离心后即可作检样获得(模板)；
(3)试剂盒操作:将一定量的PCR模板(粪或唾液样品)加入预装有试剂的PCR扩增管中，按操作参数设置，在PCR扩增仪上反应，得到扩增产物；
(4)检测:
Ca)定性PCR检测:可以在普通PCR仪上扩增，取扩增产物在3%的琼脂糖胶中进行电泳，凝胶成像观察结果；
(b)定量PCR检测:可以在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，根据达到荧光阈值的循环数，确定模板中幽门螺杆菌的数量。
[0011]所述试剂组分的体积分别为:R1试剂0.3-0.6份，R2试剂为8_12份，R3试剂为6-9份，PCR模板为1-3份。在此比例范围内，反应得到135bp的扩增产物。
[0012]所述粪便样品处理:取10-50g的粪便溶解到无菌水中混匀，然后利用梯度离心法去除粪便中的杂质获得上层清液，再将上层清液用离心法获得菌沉淀，再用无菌水将菌沉淀溶解获得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
[0013]所述口腔样本的处理为用无菌棉签在被检对象的口腔内旋转蘸取舌胎至咽喉处的口腔粘液，用无菌水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
(I)本发明以幽门螺杆菌的16s rRNA作为靶序列，得到的引物位于编码区5’端的300-400bp区域内，扩增产物在100-200bp之间，引物的碱基随机分布、均匀，此引物自身在优化的条件下不能形成二聚体，引物长度在17-25碱基之间，上下游引物不能相差3个碱基，G+C含量45-55%，引物不在AT、GC丰富的区域，不存在T/C，A/G连续结构(2_3个)，同时引物3'端不在密码子的第3位上，并且16s rRNA为幽门螺杆菌属的保守序列，可以检测特异的幽门螺杆菌属，扩大了检测范围。
[0015](2)本发明得到的135bp的引物扩增产物，在此片段的引物扩增产物的灵敏度特别高，检测灵敏度高达102CFU/ml。[0016](3)本发明采用唾液或粪便作检测样本，制备PCR模板，无创、简单、快捷。特别是唾液作为无需提取DNA，而是直接扩增样本，避免了胃镜等有创采样方法，因而能减少取样难度和取样痛苦，并且能节约检测时间和检测成本。
[0017](4)检测液体积比例的控，利于扩增产物的生成，能有效提高检测灵敏度；
(5)本发明设计筛选的引物，将退火和延伸合并为一步，步骤简单，操作便捷。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1大肠杆菌和柠檬酸杆菌按同等条件下荧光PCR扩增结果；
图2引物在不同温度下的PCR图；
图3最佳退火温度下的PCR扩增曲线图；
图4为荧光定量PCR检测的标准曲线图。
【具体实施方式】 [0019]下面根据具体实施例对本发明作进一步阐述。
[0020]但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0021]实施例用到的试剂:
菌株:幽门螺杆菌悉尼株pylori SSl(简称Hp),购自于河北医科大学，来源于中国疾病预防控制中心流行病学研究所。
[0022]Sybr Green MIX: ( CW0078, CffBio)
临床样本:感染幽门螺杆菌的小鼠和SPF的小鼠胃，粪，口腔样本:(批号201306，自
制)
大肠杆菌、柠檬酸杆菌:(批号20130522，自制)
无菌ddH20:(批号201305,自制)
Marker:(批号D503A,宝生物)
琼脂糖:(Bio-west)
IXTAE: (20121124，自制)
组织DNA提取试剂盒:(批号D5934A，Omega)
Premix Taq:(批号 D332, TAKARA)
主要的设备
电泳仪(电泳槽):(PAC-300，Bio-Rad)，凝胶成像系统:(170818，Bio-Rad)
移液器:(KA0015335，成都溶海生物公司)，普通PCR仪:(TC9600-G-230V，Iabnet)
荧光定量 PCR 管:(009701，Bio-Rad)，荧光定量 PCR 仪:(CFX, Bio-Rad)
实施例1引物的设计和特异性测试 以幽门螺杆菌的16s RNA作为靶序列，设计引物如下:
引物为 5’- TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ ；
以菌株----幽门螺杆菌悉尼株SSl (简称Hp)(购自于河北医
科大学，来源于中国疾病预防控制中心流行病学研究所)的16s RNA作为靶序列，得到的引物位于编码区5’端的300-400bp区域内，扩增产物在100-200bp之间，引物的碱基随机分布、均匀，此引物自身不能形成二聚体，引物长度在17-25碱基之间，上下游引物不能相差3个碱基，G+C含量45-55%，引物不在AT、GC丰富的区域，不存在T/C，A/G连续结构(2_3个)，同时引物3'端不在密码子的第3位上，并且16s RNA为幽门螺杆菌属的保守序列，可以检测出所有的幽门螺杆菌，扩大了检测范围，同时引物特异性好，灵敏度高。
[0023]PCR引物特异性的检测:按照上述确定的反应体系和程序，对大肠杆菌(20130522,自制)和柠檬酸杆菌(20130522，自制)进行荧光定量PCR扩增实验，其他市场流通的大肠杆菌和柠檬酸杆菌均能进行荧光定量PCR扩增实验，结果如图1。
[0024]通过图1的结果发现，大肠杆菌和柠檬酸杆菌在上述PCR条件下扩增，无扩增曲线，说明引物的特异性好，与其它肠道细菌无交叉反应。
[0025]实施例2引物的扩增反应
上述引物 5’- TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 的 PCR 扩增反应为:
在90-98°C下将引物熔链8-10s ;然后降温到56-66°C退火延伸25_30s ；
两步骤循环30cycle。现有的工艺是将温度降低到55°C左右退火处理一段时间，再升温到72°C左右延伸，而本发明的退火延伸是一个步骤，因为本发明采取的退火延伸是在同一个温度条件下进行的，因此不需要将熔炼后的产物经过2次降温，而直接将产物降温到延伸时需要的温度得到引物扩增片段，与现有引物的PCR扩增反应相比，省去了一次降温步骤，而节约了操作工序和操作时间，进而节约了成本。
[0026]引物退火温度可选择56、58、60、62、64、66°C,最佳退火温度为62°C。
[0027]引物退火温度的确定:分别设置56、58、60、62、64、66<€退火,米用同样的程序份反应物在普通PCR仪进行扩增反应，反应结束后在3%的琼脂糖胶中进行电泳，120V, 30min,凝胶成像系统中观察结果如图2。从图上可以看到在引物退火温度为62°C时检测最为明显、效果最佳。最佳退火温度下的PCR扩增曲线参见图3。
[0028]实施例3 —种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒
一种无创核酸检测幽门螺杆菌的试剂盒包括Rl试剂:引物5’ -TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ ，
R2 试剂:SYBR Green Taq MIX( CW0078, CWBio)，其他的 PCR Taq 酶预混合液也可以；R3试剂:为无菌蒸馏水(201305，自制)。
[0029]实施例4粪便样品和口腔中幽门螺杆菌的无创检测方法
1、试剂盒配置:
无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒配制:引物Rl用无菌蒸馏水稀释到终浓度8-10 μ Μ，SYBR Green Taq MIX为R2试剂；灭菌的蒸馏水作为R3试剂。将上述试剂组分别包装或预混合包装，如PCR扩增管分别预装Rl或R2或R3，配置成试剂盒，又如PCR扩增管预装R1、R2和R3的混合物。
[0030]2、粪便样品及PCR反应
取10-50g的确定感染幽门螺杆菌的粪便溶解到300μ I无菌水中混匀，然后利用梯度离心法先用800-1000r/min离心去除粪便中的杂质获得上层清液，再将上层清液用8000-10000r/min离心转速离心获得菌沉淀，再用300 μ I无菌水将菌沉淀溶解获得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
[0031]含R1、R2和R3混合物预包装或者分别预包装的PCR反应管配置成试剂盒，按试剂盒操作加样，将PCR模板加入预装有试剂的PCR扩增管中，试剂组分的体积分别为:R1试剂
0.3-0.6份，R2试剂为8-12份，R3试剂为6_9份，PCR模板为1_3份。在此比例范围内，反应得到135bp的扩增产物。
[0032]在92_96°C下进行8-10s的熔链；然后在56_66°C下进行25_30s的退火延伸，得到的135bp的扩增产物通过PCR方法定性检测(在普通PCR仪上进行扩增反应)、定量PCR检测(突光PCR仪上进行扩增反应)得到结果。
[0033]3、口腔样本及PCR反应
用无菌棉签在确定感染幽门螺杆菌的小鼠的口腔内旋转蘸取舌胎至咽喉处的口腔粘液，用100 μ I无菌生理盐水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
[0034]含R1、R2和R3混合物预包装或者分别预包装的PCR反应管配置成试剂盒，按试剂盒操作加样，将PCR模板加入预装有试剂的PCR扩增管中。试剂组分的体积分别为:R1试剂0.3-0.6份，R2试剂为8-12份，R3试剂为6_9份，PCR模板为1_3份。在此比例范围内，反应得到135bp的扩增产物。
[0035]按试剂盒操作加样，在92_96°C下进行8-lOs的熔链；然后在56_66 °C下进行25-30s的退火延伸，得到的135bp的扩增产物通过PCR方法定量检测得到结果，通过定性PCR检测(在普通PCR仪上进行扩增反应)、定量PCR检测(荧光PCR仪上进行扩增反应)得到结果。
[0036]口腔、粪便的定性PCR检测、定量PCR检测和胃组织PCR、胃组织快速尿酶检测的比较对确定Hp感染和未知感染小鼠的粪便、口腔样本和已幽门螺杆菌感染病人的口腔样本进行PCR检测和采用同批次已知Hp感染、非感染小鼠以及已幽门螺杆菌感染病人的胃组织PCR、胃组织快速尿酶检测，以已知Hp感染的小鼠作为阳性参照物，无感染的SPF小鼠为阴性参照物。
[0037]按照上述粪便样品处理和口腔样本的处理方法对检测样品进行处理，此样本来源于幽门螺杆菌感染的实验小鼠口腔(批号201306，自制)和粪便(批号201306，自制)，根据对小鼠的胃组织DNA进行定性PCR检测，确定了小鼠是否感染幽门螺杆菌；已幽门螺杆菌感染病人的口腔样本来自于华西消化内科的幽门螺杆菌感染病人口腔黏膜。
[0038]定性PCR检测比较结果经过对上述样本的粪便、口腔定性PCR检测和同批次已知感染或非感染个体的胃组织作定性PCR检测，具体结果比较如下。
[0039]
【权利要求】
1.一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒的引物，其特征在于:所述引物为5’-TTGGGATAGCCATTGGAAACG _3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 。
2.权利要求1所述的引物的扩增方法，其特征在于:该方法包括以下步骤 熔链:在92-96°C下进行8-10s ； 退火延伸:在54-66°C下进行25-30S，退火延伸是在同样的温度下进行； 该两个步骤按顺序循环30cycle。
3.根据权利要求2所述的引物的扩增方法，其特征在于:所述退火温度为62°C。
4.一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的引物R1，还包括R2试剂、R3试剂，所述R2试剂为SYBR Green Taq MIX,所述R3试剂为无菌蒸馏水。
5.一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于:该检测方法采用权利要求4所述的无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒，包括以下步骤: (O无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒配置:将引物Rl用无菌蒸馏水稀释到终浓度8-10 μ Μ,再将稀释后的Rl试剂、R2试剂，R3试剂分别包装或预混合包装得PCR扩增管，制得试剂盒； (2)PCR模板制备:将粪便样品处理或口腔样本处理后制得PCR模板； (3)试剂盒操作:将PCR模板加入预装有试剂的PCR扩增管中，在PCR扩增仪上如权利要求2或3所述的引物扩增方法进行反应，得到扩增产物； (4)检测:(a)定性PCR检测:在普通PCR仪上扩增，取扩增产物在3%的琼脂糖胶中进行电泳，凝胶成像观察结果； (b)定量PCR检测:在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，根据达到荧光阈值的循环数，确定模板中幽门螺杆菌的数量。
6.根据权利要求5所述的一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于:所述粪便样品处理:取10_50g的粪便溶解到无菌水中混匀，然后利用梯度离心法去除粪便中的杂质获得上层清液，再将上层清液用离心法获得菌沉淀，再用无菌水将菌沉淀溶解获得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
7.根据权利要求5所述的一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于:所述口腔样本的处理为 用无菌棉签在口腔内旋转蘸取舌胎至咽喉处的口腔粘液，用无菌水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作为PCR模板。
8.根据权利要求5所述的一种无创幽门螺杆菌基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于:引物、Rl试剂、R2试剂和PCR模板体积为:R1试剂为0.3-0.6份，R2试剂为8-12份，R3试剂为6-9份，PCR模板为1-3份。
【文档编号】C12N15/11GK103834741SQ201410101308
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】祝洁, 张勇 申请人:四川万可泰生物技术有限责任公司