稀有细胞过滤器及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种稀有细胞过滤器及其应用。过滤器包括过滤管，过滤管一端开口，过滤管内设置有沿过滤管内壁滑动的弹性密封头，弹性密封头上方配合设置有沿过滤管内壁滑动的注射筒，注射筒包括两端开口的筒管，筒管一端上方设置有筒盖，筒盖下方的筒管开口处设置有过滤支撑环，过滤支撑环上设置有覆盖开口的微孔阵列滤膜，筒管、弹性密封头和过滤支撑环形成回收池，滤膜由锥形微孔或口径不同的双层微孔阵列构成，回收池内设置有样品细管，样品细管一端穿过过滤支撑环伸入过滤腔中，另一端穿过弹性密封头伸入封闭腔中。本发明解决了捕获稀有细胞选择性及灵敏度差的问题，适用于人体外周血液中循环肿瘤细胞及胎儿循环细胞的高效捕获、培养及分析。
【专利说明】稀有细胞过滤器及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞过滤器，具体地指一种适用于人体外周血液中循环肿瘤细胞及胎儿循环细胞的捕获及与之相关的体外早期诊断、辅助诊断、个体化治疗、化疗药物评估、肿瘤复发监测及药物开发的细胞过滤器。
【背景技术】
[0002]癌症是当影响人类健康的头号大敌和最常见的致死因素。虽然人们对癌症的诊断和治疗已有大量的研究和实践，也发展了很多有效的技术和方法，但这些技术和方法对诊断和治疗两个方面的需求还有很大的不足。例如，我们还不能做到很好的早期诊断与化疗评估。目前常用的影像技术，包括超声(US )、计算机断层显像(CT )、核磁共振成像(MRI)和正电子发射计算机断层显像(PET)对直径小于2~3毫米的肿瘤难以确认，且在很多情况下对所观察到的肿瘤浸润能力不易判断。另外，影像技术所用射线对健康也有一定危害。目前常用的另一技术是对从活体组织上取下的病变组织进行组织切片分析。这种方法局限性在于难以确定肿瘤转移的发生，且该方法是侵入性的，有可能对肿瘤组织造成刺激从而促进肿瘤的转移，因而不能作为监测肿瘤进展、治疗效果或复发的常规方法。第三种是基于血液学的检查方法:当原发肿瘤和/或转移肿瘤释放抗原或其它与癌变相关的标志物在人体外周血液中可被检测出时，便提示了肿瘤的存在，但有些其它的原因如炎症等也可导致这些标志物的增加，所以不能确诊，另外，此类血液检查也不能对化疗疗效做出准确快速的判断。研究表明，人体外周血液中癌症细胞的数量、种类和特性可以作为癌症的重要标志物，如果能够快速捕获血液中的癌症细胞，就有希望在早期发现癌症并改变护理治疗。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种稀有细胞过滤器及其应用，本发明解决了在稀有细胞捕获过程中选择性及灵敏度差的问题，能在短时间内实现高效和可靠地稀有细胞捕获和检测，同时筛选膜的制作工艺简单，应用方便、可靠、且效率高。
[0004]为解决上述技术问题，本发明提供的一种稀有细胞过滤器，它包括过滤管，所述过滤管一端开口，所述过滤管内设置有沿过滤管内壁滑动的弹性密封头，所述过滤管与弹性密封头形成能容纳液体的封闭腔，所述弹性密封头上方配合设置有沿过滤管内壁滑动的注射筒，所述注射筒包括两端开口的筒管，所述筒管一端上方设置有筒盖，所述筒盖下方的筒管开口处设置有过滤支撑环，所述过滤支撑环上设置有覆盖开口的微孔阵列滤膜，所述筒盖、筒管和过滤支撑环形成过滤腔，所述筒管、弹性密封头和过滤支撑环形成回收池，所述回收池内设置有样品细管，所述样品细管一端穿过过滤支撑环伸入过滤腔中，另一端穿过弹性密封头伸入封闭腔中，所述筒管上部的侧壁开设有通气孔。
[0005] 进一步地，所述微孔阵列滤膜设置在过滤支撑环内壁上，在所述微孔阵列滤膜下方还设置有过滤网，所述过滤网固定在过滤支撑环内壁上。
[0006]再进一步地，所述筒盖的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台，所述圆形凸台与筒盖的筒壁之间形成环形凹槽，所述环形凹槽内设置有密封垫圈，所述圆形凸台的下方设置小于圆形凸台直径且有多个侧向缺口的空心圆柱，所述空心圆柱与微孔阵列滤膜之间设置有密封垫圈。
[0007]再进一步地，所述筒盖的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台，所述圆形凸台与筒盖的筒壁形成环形凹槽，所述环形凹槽内设置有密封垫圈，所述圆形凸台上设置小于凸台直径且有多个侧向缺口的空心圆柱，所述微孔阵列滤膜设置在空心圆柱内壁上，所述微孔阵列滤膜与过滤支撑环之间设置有密封垫圈。
[0008]再进一步地，所述筒盖中央设置有圆柱状的附加进样口，所述附加进样口上配套设置有附加进口盖。
[0009]再进一步地，所述过滤管的开口处向外呈“ α ”角伸展，其外壁上设置有斜角加固环，其中所述“α ”角的角度为5~45°。
[0010]再进一步地，所述筒管另一端还设有连接管，所述连接管的另一端设置有环形卡边，所述弹性密封头设置有凹槽，所述凹槽的槽口边缘设置有环形卡板，所述环形卡边位于凹槽内。
[0011 ] 再进一步地，所述筒管与筒盖通过螺纹连接。
[0012]再进一步地，所述微孔阵列滤膜由密集规则排列的锥形微孔或双层微孔阵列构成，所述锥形微孔或双层微孔位于过滤腔一端的孔径小于位于回收池一端的孔径。
[0013]再进一步地，所述过滤管外壁的直径为10~100mm，高度为10~300mm，管壁壁厚为I~8mm η
[0014]再进一步地，所述筒管的直径为9~99mm，高度为10~300mm，管壁壁厚为I~8mm η
[0015]再进一步地,所述筒盖直径为12~105mm,高度为5~30mm,管壁壁厚为I~8_。
[0016]再进一步地,所述附加进样口内径为0.5~IOmm,外径为I~12mm,高度为2~10mnin
[0017]再进一步地，所述样品细管内径为0.1~3晕米之间，外径为0.5~5晕米。
[0018]再进一步地，所述通气孔的直径为0.1~2_，开孔位置与筒管顶部之间的距离为5 ~10mnin
[0019]再进一步地，所述过滤支撑环外部直径为10~100mm，所述支撑网的网孔直径为
0.2~5臟，网孔密度为9~900/cm2,厚度为0.5~2臟。
[0020]再进一步地，所述微孔阵列滤膜的厚度为10~100 μ m,小孔径直径为I~20 μ m，大孔径直径为5~100 μ m,所述微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离为2~500 μ m。
[0021]再进一步地，所述筒管上部外壁上设置有加固环。
[0022]本发明还提供了一种稀有细胞过滤器在细胞捕获固定及染色、细胞成像及计数过程中的应用，包括以下步骤:
[0023]1)灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0024]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上；
[0025]3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜的筒盖通过螺纹旋于筒管上，确保密封，将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入封闭腔，将注射筒缓慢推进至过滤管底部，使含有癌细胞的磷酸盐缓冲液通过样品细管进入微孔阵列滤膜中进行细胞捕获；
[0026]4)细胞固定:上述细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，用多聚甲醛溶液将捕获在膜上的细胞固定；
[0027]5)细胞染色:依次加入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相特异结合；
[0028]6)成像与分析:用荧光显微镜对微孔阵列滤膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
[0029]本发明还提供了一种稀有细胞过滤器在细胞培养、扩增过程中的应用，包括以下步骤:
[0030]I)灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0031]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上；
[0032]3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜的筒盖通过螺纹旋于筒管上，确保密封，将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入封闭腔，将注射筒缓慢推进至过滤管底部，使含有癌细胞的磷酸盐缓冲液通过样品细管进入微孔阵列滤膜中进行细胞捕获；
[0033]4)细胞培养:待细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，将滤膜轻置于96孔板中，缓慢加入细胞培养液后置于细胞培养箱中。
[0034]本发明还提供了一种高效稀有细胞过滤器用于血样中循环肿瘤细胞捕获应用方法，包括如下步骤:
[0035]I)灭菌:将细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0036]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上；
[0037]3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜的筒盖通过螺纹旋于筒管上，确保密封，将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入封闭腔，将注射筒缓慢推进至过滤管底部，使含有癌细胞的磷酸盐缓冲液通过样品细管进入微孔阵列滤膜中进行细胞捕获；
[0038]4)血样处理:分别取病人血样用PBS溶液稀释；
[0039]5)细胞捕获:将微孔阵列滤膜装入注射筒上，确保密封，将血样注入封闭腔内，将注射筒缓慢推进至过滤管底部；
[0040]6)细胞固定:待细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，用多聚甲醛溶液将捕获在膜上的细胞固定；
[0041]7)细胞染色:依次加入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相特异结合；
[0042]8)成像与分析:用荧光显微镜对微孔阵列滤膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的癌细胞的数目以及对应的捕获效率。
[0043]本发明的有益效果在于:
[0044]I)细胞过滤器的注射筒的推进速度可控制在一定范围内，因此可以调节样品通过滤膜的流量。2)当样品通过滤膜的流量较小时，滤膜两边的压差也较小，因而确保所捕获的稀有细胞被保留及其活性不受较大的影响。
[0045]3)通过注射筒使样品经导流细管输入到滤膜上部的腔体再经滤膜流入到注射筒下部的样品回收池的方式确保流体样品经过膜的时候有一横流分量，从而减少流体样品中细胞在膜表面没有孔的部分的停留；
[0046]4)当选用高效过滤膜时，血液中除稀有细胞外的所以成分都可开始通过滤膜，因而确保滤膜的通透性或滤膜两边的压差不变，从而使所捕获的稀有细胞被保留及其活性不受压差的影响
[0047]3)稀有细胞捕获后，可以方面地将滤膜取出进行细胞培养、细胞处理与成像检测及细胞分子水平的进一步分析；
[0048]5)本发明为癌症早期诊断、化疗药物评估、个体化治疗、肿瘤复发监测及肿瘤药物的开发等提供了一种可靠的手段；
[0049]6)本发明的细胞过滤器应用方便、可靠、且效率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1为具有过滤网的稀有细胞过滤器的结构示意图；
[0051]图2为没有设置过滤网的稀有细胞过滤器的结构示意图；
[0052]图3为过滤管的结构示意图；
[0053]图4为筒盖开设附加进样口的结构示意图；
[0054]图5为筒管的结构示意图；
[0055]图6为弹性密封头的结构示意图；
[0056]图7为微孔阵列滤膜结构示意图；
[0057]图8为图7的A-A剖视图，其中，A是显示锥形微孔滤膜加固环的示意图，A是双层微孔阵列及滤膜加固环的示意图；
[0058]图9为捕获于细胞过滤膜上的HT29细胞荧光图；
[0059]图10为捕获于细胞过滤膜上的HT29细胞经过3天培养后的显微图；
[0060]图11为血样通过细胞过滤膜后的荧光图；
[0061]DAPI标识的为所以细胞的细胞核，CK标识的为癌细胞角蛋白，CD45标识的为白细胞，Merge为三色荧光组合图。标尺长度为40微米。
[0062]图中，1.过滤管、2.注射筒(2.1.筒管(2.11.连接管、2.12.环形卡边、)、2.2.过滤支撑环(2.21.过滤网)、2.3.微孔阵列滤膜、2.31.滤膜加固环、2.32.滤膜的锥形微孔阵列、2.33.滤膜的双层微孔阵列、2.4.筒盖、2.41.附加进样口、2.42.附加进口盖、2.43.圆形凸台、2.44.环形凹槽、2.45.空心圆柱)、3.封闭腔、4.过滤腔、5.回收池、6.样品细管、
7.通气孔、 8.斜角加固环、9.密封垫圈、10.加固环、11.弹性密封头(11.1.凹槽、11.2.环形卡板)。
【具体实施方式】
[0063]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0064]实施例1[0065]如图1、图3和图5所示:稀有细胞过滤器，它包括过滤管1，过滤管1 一端开口，过滤管I的开口处向外呈30°角伸展，其外壁上设置有斜角加固环8。过滤管I内设置有沿过滤管1内壁滑动的弹性密封头11，过滤管I与弹性密封头11形成能容纳液体的封闭腔3，弹性密封头11上方配合设置有沿过滤管I内壁滑动的注射筒2，注射筒2包括两端开口的筒管2.1，筒管2.1与筒盖2.4通过螺纹连接。筒管2.1上部外壁上设置有加固环10
[0066]筒管2.1另一端还设有连接管2.11，连接管2.11的另一端设置有环形卡边2.12，弹性密封头11设置有凹槽11.1，凹槽11.1的槽口边缘设置有环形卡板11.2，环形卡边2.12位于凹槽11.1内。使得筒管2.1与连接管2.11卡合连接。
[0067]筒盖2.4下方的筒管2.1开口处设置有过滤支撑环2.2，过滤支撑环2.2上设置有覆盖开口的微孔阵列滤膜2.3，筒盖2.4、筒管2.1和过滤支撑环2.2形成过滤腔4，筒管2.1、弹性密封头11和过滤支撑环2.2形成回收池5，回收池5内设置有样品细管6，样品细管6 —端穿过过滤支撑环2.2伸入过滤腔4中，另一端穿过弹性密封头11伸入封闭腔3中，筒管2.1上部的侧壁开设有通气孔7。
[0068]微孔阵列滤膜2.3设置在过滤支撑环2.2内壁上，在微孔阵列滤膜2.3下方还设置有过滤网2.21，过滤网2.21固定在过滤支撑环2.2内壁上。
[0069]筒盖2.4的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台2.43，圆形凸台2.43与筒盖2.4的筒壁之间形成环形凹槽2.44，环形凹槽2.44内设置有密封垫圈9，圆形凸台2.43的下方设置小于圆形凸台2.43直径且有多个侧向缺口的空心圆柱2.45，空心圆柱2.45与微孔阵列滤膜2.3之间设置有密封垫圈9。
[0070]微孔阵列滤膜2.3由滤膜加固环2.31与密集规则排列的锥形微孔2.32或双层微孔2.33阵列构成，锥形微孔或双层微孔位于过滤腔4 一端的孔径小于位于回收池5—端的孔径。
[0071]过滤管I外壁的直径为10~100mm,高度为10~300mm,管壁壁厚为1~8mm。
[0072]筒管2.1的直径为9~99mm,高度为10~300mm,管壁壁厚为1~8_。
[0073]筒盖2.4直径为12~105mm,高度为5~30mm,管壁壁厚为1~8_。
[0074]附加进样口 2.41内径为0.5~IOmm,外径为1~12mm,高度为2~10_。
[0075]样品细管6内径为0.1~3毫米之间，外径为0.5~5毫米。
[0076]通气孔7的直径为0.1~2mm，开孔位置与筒管2.1顶部之间的距离为5~10mm。
[0077]过滤支撑环2.2外部直径为10~100mm,支撑网2.21的网孔直径为0.2~5mm,网孔密度为9~900/cm2,厚度为0.5~2_。
[0078]微孔阵列滤膜2.3的厚度为10~100 μ m,小孔径直径为1~20 μ m，大孔径直径为5~100 μ m,微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离为2~500 μ m。
[0079]稀有细胞过滤器的规格大小，根据实际情况进行设计。其全部部件由生物相容性材料制成。
[0080]实施例2
[0081]如图2、图3和图5所示，本实施例与实施例1的稀有细胞过滤器基本相同，不同之处在于:
[0082] 筒盖2.4的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台2.43，圆形凸台2.43与筒盖2.4的筒壁形成环形凹槽2.44，环形凹槽2.44内设置有密封垫圈9，圆形凸台2.43上设置小于凸台直径且有多个侧向缺口的空心圆柱2.45，微孔阵列滤膜2.3设置在空心圆柱2.45内壁上，微孔阵列滤膜2.3与过滤支撑环之间设置有密封垫圈9。[0083]实施例3
[0084]如图1、图3、图4和图5所示:本实施例与实施例1的稀有细胞过滤器基本相同，不同之处在于:
[0085]筒盖2.4中央设置有圆柱状的附加进样口 2.41，附加进样口 2.41上配套设置有附加进口盖2.42。
[0086]实施例4
[0087]如图2~5所示:本实施例与实施例1的稀有细胞过滤器基本相同，不同之处在于:
[0088]筒盖2.4中央设置有圆柱状的附加进样口 2.41，附加进样口 2.41上配套设置有附加进口盖2.42。
[0089]实施例5
[0090]使用实施例2中稀有细胞过滤器用于捕获PBS溶液中参杂直肠癌细胞HT29，包括下述步骤:
[0091]I)灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0092]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的20 μ I的MaxGel溶液(I: 100比例稀释在PBS溶液中)置于微孔阵列滤膜2.3表面，在细胞培养箱中修饰I小时后，移去残留溶液，在通风橱中放置30分钟后，将微孔阵列滤膜2.3通过密封垫圈9固定在筒盖2.4上；
[0093]3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜2.3的筒盖2.4通过螺纹旋于筒管2.1上，确保密封，将IOml含有直肠癌细胞ΗΤ29的PBS溶液注入封闭腔3内，将注射筒2缓慢推进至I底部；
[0094]4)细胞固定:待细胞捕获完成后，取下筒盖2.4和微孔阵列滤膜2.3，用浓度为4%的多聚甲醛溶液将捕获在膜上的ΗΤ29细胞固定；
[0095]5)细胞染色:依次加入0.2%的Triton-XlOO通透液和1%的牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理，再将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；
[0096]6)成像与分析:用荧光显微镜对滤膜上的捕获的ΗΤ29细胞进行成像并分析捕获的癌症细胞的数目以及对应的捕获效率。
[0097]图9为捕获于细胞过滤膜上的ΗΤ29细胞荧光。DAPI标识为所有细胞核，CK标识的为ΗΤ29细胞角蛋白，Merge为DAPI与CK的组合图。标尺长度为100微米。
[0098]实施例6
[0099]使用实施例2中稀有细胞过滤器用于培养直肠癌细胞HT29，包括下述步骤:
[0100]I)高温灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0101]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的20 μ I的MaxGel溶液(1:100比例稀释在PBS溶液中)置于微孔阵列滤膜2.3表面，在细胞培养箱中修饰I小时后，移去残留溶液，在通风橱中放置30分钟后，将微孔阵列滤膜2.3通过密封垫圈9固定在过滤支撑环2.2上；
[0102]3)细胞捕获:将筒盖2.4通过螺纹旋于筒管2.1上，确保密封，将IOml含有直肠癌细胞HT29的PBS溶液注入封闭腔3内，将注射筒2缓慢推进至I底部；
[0103]4)细胞培养:待细胞捕获完成后，取下筒盖2.4和微孔阵列滤膜2.3，将滤膜轻置于96孔板中，缓慢加入1ml细胞培养液后置于细胞培养箱中。
[0104]如图10所示，细胞过滤器获得了 HT29细胞置于培养基中培养，经过3天培养后的得到培养细胞。
[0105]实施例7
[0106]使用实施例2中稀有细胞过滤器用于捕获PBS溶液中参杂直肠癌细胞HT29，包括下述步骤:
[0107]1)灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌；
[0108]2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的20 μ I的MaxGel溶液(1:100比例稀释在PBS溶液中)置于微孔阵列滤膜2.3表面，在细胞培养箱中修饰I小时后，移去残留溶液，在通风橱中放置30分钟后，将微孔阵列滤膜2.3通过密封垫圈9固定在筒盖2.4上；
[0109]3)血样处理:分别取正常人血样5毫升，PBS溶液4毫升，含有直肠癌细胞ΗΤ29的PBS溶液I毫升，并混合；
[0110]4)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜2.3的筒盖2.4通过螺纹旋于筒管2.1上，确保密封，将IOml含有直肠癌细胞ΗΤ29的PBS溶液注入封闭腔3内，将注射筒2缓慢推进至I底部；
[0111]5)细胞固定:待细胞捕获完成后，取下筒盖2.4和微孔阵列滤膜2.3，用浓度为4%的多聚甲醛溶液将捕获在膜上的ΗΤ29细胞固定；
[0112]6)细胞染色:细胞染色:依次加入0.2%的Triton-XlOO通透液和1%的牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理，再将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合；
[0113]7)成像与分析:用荧光显微镜对滤膜上的捕获的ΗΤ29细胞细胞进行成像并分析捕获的ΗΤ29细胞的数目以及对应的捕获效率。
[0114]图11为血样通过过滤膜后所捕获的ΗΤ29细胞荧光。DAPI标识为所有细胞核，CK标识的为ΗΤ29细胞角蛋白，⑶45标识的为白细胞，Merge为DAP1、CK与⑶45的组合图。标尺长度为100微米。
[0115]其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【权利要求】
1.一种稀有细胞过滤器，其特征在于:它包括过滤管(1)，所述过滤管(1) 一端开口，所述过滤管(1)内设置有沿过滤管(1)内壁滑动的弹性密封头(11)，所述过滤管(1)与弹性密封头(11)形成能容纳液体的封闭腔(3 )，所述弹性密封头(11)上方配合设置有沿过滤管(1)内壁滑动的注射筒(2)，所述注射筒(2)包括两端开口的筒管(2.1)，所述筒管(2.1)一端上方设置有筒盖(2.4)，所述筒盖(2.4)下方的筒管(2.1)开口处设置有过滤支撑环(2.2)，所述过滤支撑环(2.2)上设置有覆盖开口的微孔阵列滤膜(2.3)，所述筒盖(2.4)、筒管(2.1)和过滤支撑环(2.2)形成过滤腔(4)，所述筒管(2.1)、弹性密封头(11)和过滤支撑环(2.2)形成回收池(5)，所述回收池(5)内设置有样品细管(6)，所述样品细管(6)—端穿过过滤支撑环(2.2)伸入过滤腔(4)中，另一端穿过弹性密封头(11)伸入封闭腔(3)中，所述筒管(2.1)上部的侧壁开设有通气孔(7)。
2.根据权利要求1所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述微孔阵列滤膜(2.3)设置在过滤支撑环(2.2)内壁上，在所述微孔阵列滤膜(2.3)下方还设置有过滤网(2.21)，所述过滤网(2.21)固定在过滤支撑环(2.2)内壁上。
3.根据权利要求2所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒盖(2.4)的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台(2.43)，所述圆形凸台(2.43)与筒盖(2.4)的筒壁之间形成环形凹槽(2.44)，所述环形凹槽(2.44)内设置有密封垫圈(9)，所述圆形凸台(2.43)的下方设置小于圆形凸台(2.43 )直径且有多个侧向缺口的空心圆柱(2.45 )，所述空心圆柱(2.45)与微孔阵列滤膜(2.3)之间设置有密封垫圈(9)。
4.根据权利要求1所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒盖(2.4)的盖顶内壁上设置有小于盖顶的直径的圆形凸台(2.43)，所述圆形凸台(2.43)与筒盖(2.4)的筒壁形成环形凹槽(2.44)，所述环形凹槽(2.44)内设置有密封垫圈(9)，所述圆形凸台(2.43)上设置小于凸台直径且有多个侧向缺口的空心圆柱(2.45)，所述微孔阵列滤膜(2.3)设置在空心圆柱(2.45)内壁上，所述微孔阵列滤膜(2.3)与过滤支撑环之间设置有密封垫圈(9)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒盖(2.4)中央设置有圆柱状的附加进样口(2.41)，所述附加进样口(2.41)上配套设置有附加进口盖(2.42)。
6.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述过滤管(I)的开口处向外呈“ α ”角伸展，其外壁上设置有斜角加固环(8)，其中所述“ α ”角的角度为5~45。。
7.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒管(2.1)另一端还设有连接管(2.11)，所述连接管(2.11)的另一端设置有环形卡边(2.12)，所述弹性密封头(11)设置有凹槽(11.1 )，所述凹槽(11.1)的槽口边缘设置有环形卡板(11.2 )，所述环形卡边(2.12)位于凹槽(11.1)内。
8.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒管(2.1)与筒盖(2.4)通过螺纹连接。
9.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述微孔阵列滤膜(2.3)由滤膜加固环(2.31)及密集规则排列的锥形微孔(2.32)或双层微孔(2.33)阵列构成，所述锥形微孔或双层微孔位于过滤腔(4) 一端的孔径小于位于回收池(5) —端的孔径。
10.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述过滤管(I)外壁的直径为10~100mm,高度为10~300mm,管壁壁厚为I~8mm。
11.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒管(2.1)的直径为9~99mm,高度为10~300mm,管壁壁厚为I~8mm。
12.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒盖(2.4)直径为12~105mm,高度为5~30mm,管壁壁厚为I~8mm。
13.根据权利要求5所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述附加进样口(2.41)内径为0.5~ICtam,外径为I~12臟，高度为2~10mnin
14.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述样品细管(6)内径为0.1~3晕米之间，外径为0.5~5晕米。
15.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述通气孔(7)的直径为0.1~2mm，开孔位置与筒管(2.1)顶部之间的距离为5~10mm。
16.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述过滤支撑环(2.2)外部直径为10~100mm，所述支撑网(2.21)的网孔直径为0.2~5mm，网孔密度为9 ~900/cm2,厚度为 0.5 ~2mm。
17.根据权利要求1-4任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述微孔阵列滤膜(2.3)的厚度为10~100 μ m，小孔径直径为I~20 μ m，大孔径直径为5~100 μ m，所述微孔阵列滤膜的两个小孔间圆心距离为2~500 μ m。
18.根据权利要求1-4 任一项所述的稀有细胞过滤器，其特征在于:所述筒管(2.1)上部外壁上设置有加固环(10)。
19.一种权利要求1所述稀有细胞过滤器在细胞捕获固定及染色、细胞成像及计数过程中的应用，其特征在于:包括以下步骤: 1)灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌； 2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上； 3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜的筒盖通过螺纹旋于筒管上，确保密封，将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入封闭腔，将注射筒缓慢推进至过滤管底部，使含有癌细胞的磷酸盐缓冲液通过样品细管进入微孔阵列滤膜中进行细胞捕获； 4)细胞固定:上述细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，用多聚甲醛溶液将捕获在膜上的细胞固定； 5)细胞染色:依次加入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；再将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合； 6)成像与分析:用荧光显微镜对微孔阵列滤膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的细胞的数目以及对应的捕获效率。
20.一种权利要求1所述稀有细胞过滤器在细胞培养、扩增过程中的应用，其特征在于，包括以下步骤: O灭菌:将稀有细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌； 2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上；3)细胞捕获:将装有微孔阵列滤膜的筒盖通过螺纹旋于筒管上，确保密封，将含有癌细胞的磷酸盐缓冲液注入封闭腔，将注射筒缓慢推进至过滤管底部，使含有癌细胞的磷酸盐缓冲液通过样品细管进入微孔阵列滤膜中进行细胞捕获； 4)细胞培养:待细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，将滤膜轻置于96孔板中，缓慢加入细胞培养液后置于细胞培养箱中培养。
21.一种权利要求1所述高效稀有细胞过滤器用于血样中循环肿瘤细胞捕获应用方法，其特征在于，包括如下步骤: O灭菌:将细胞过滤器置于紫外光线下进行灭菌； 2)细胞过滤膜的表面修饰:取预先配好的蛋白溶液置于微孔阵列滤膜表面进行表面修饰，然后将微孔阵列滤膜通过密封垫圈固定在注射筒筒盖上； 3)血样处理:分别取病人血样用磷酸盐缓冲液溶液稀释； 4)细胞捕获:将微孔阵列滤膜装入注射筒上，确保密封，将血样注入封闭腔内，将注射筒缓慢推进至过滤管底部； 5)细胞固定:待细胞捕获完毕后，取下注射筒筒盖和微孔阵列滤膜，用多聚甲醛溶液将捕获在膜上的细胞固定； 6)细胞染色:依次加入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白对细胞进行染色前处理；将有荧光素标记的抗体置于膜上，并使之与细胞表面的特异抗原或细胞的癌症标记物相结合； 7)成像与分析:用荧光显微镜对微孔阵列滤膜上的捕获的细胞进行成像并分析捕获的癌细胞的数目以及对应的捕获效率。
【文档编号】C12M1/12GK103881903SQ201410109918
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】陈勇, 唐亚东, 石剑, 汪莉 申请人:武汉介观生物科技有限责任公司