一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及其应用，属于家畜基因工程【技术领域】。该分子标记由IP10基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。序列表SEQIDNO：2所示序列的第119位碱基处有一个C119-T119的碱基突变，导致RFLP-MspI多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
【专利说明】一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜基因工程【技术领域】，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，现代育种技术在改良猪生产性状方面做出了很大贡献，但对健康和抵抗疾病的能力的遗传改良确没有得到足够重视。一些预防性措施的应用，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物和疫苗等，在现代养猪业中发挥了重要作用，但随着全球对减少药物和疫苗使用的呼声越来越高，采用分子遗传学方法从本质上提高畜禽机体自身抗病能力越来越受到关注，成为研究的重点。
[0003]个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Knap等,2000),它属于数量性状,其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。因此，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。
[0004]对于猪抗病性状的候选基因，研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因。研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，1998)，- (1，2)_海藻糖转移酶 I ( α (I, 2) fucosyltransferase，FUTl)基因是 F18 受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上(Vogeli P等，1992)。氟烷基因(Hal)是另一个影响较大的抗性相关基因，它的氟烷敏感等位基因(Haln )可导致猪的体质和抵抗力下降，产生剧烈的应激反应。猪的干扰素被证明对繁殖障碍与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、胃肠炎冠状病毒等多种重大传染病病毒均具有广谱防御和抑制作用，因而干扰素基因、干扰素受体基因是选择猪的非特异性抗病力的重要候选基因。另外，MHC已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Peelman等，1996),其它有研究的与抗病力有关的基因是MXl (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子 I )、NRAMPl (Natural resistance-associatedmacrophage protein I,与巨卩遼细胞有关的天然抗性蛋白I), ILl (Interleukins I,白细胞介素 1)、PPARG (Peroxisome proliferator activated receptor gamma,过氧化物酶体增殖激活受体Y)等基因。
[0005]IPlO是属于CXC家族的趋化因子，又名CXCL10，主要是由单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等受到IFNy刺激后诱导分泌的。IPlO能介导Thl型炎症反应。IPlO作为单核细胞和活化T淋巴细胞的趋化因子，能刺激单核细胞，活化T淋巴细胞的定向迁移，并增加T细胞对内皮细胞的黏附作用(Taub et al., 1993)。IPlO激活Thl细胞能够发挥一下几个方面的生物学作用:(1)参与某些迟发型超敏反应疾病的发生。在活动性肺结核病的支气管肺泡中IPlO的表达水平很高；另有研究发现同种异体移植中使用IPlO单克隆抗体可以延长移植物的存活时间，即说明阻断IPlO后能抑制移植排斥反应的发生；(2)参与自身免疫性疾病的发生。不仅在SLE患者的血清中检测到高水平表达的IP10，而且有学者发现其可能是I型糖尿病的诱因(Li et al., 2005)，IPlO激活Thl型细胞，从而激活细胞毒性巨噬细胞、细胞毒性T细胞和NK细胞，攻击胰岛细胞导致胰岛B细胞破坏引起I型糖尿病；(3)抗病毒免疫功能。在疱疹病毒感染人脑时，发现外源的IPlO能直接抵抗病毒的复制，增强小胶质细胞抗病毒的防御反应，并且增强免疫应答效应(Lokensgard et al., 2001) ； (4)具有抑制血管新生的作用。它作为体内血管新生抑制因子之一，能有效抑制IL8和bFGF引起的血管新生(Angiolillo et al.，1995),其作用主要表现在参与血管重塑的调节和抑制肿瘤生长迁移两个方面。IPlO通过抑制肿瘤的血管新生，减少肿瘤血液供给，导致肿瘤缺血坏死，同时它能将T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞等趋化至肿瘤发生部位，诱导Thl型炎症反应从而杀伤肿瘤细胞，最终发挥抗肿瘤的重要生物学作用。
[0006]迄今为止，尚未见全面研究猪IPlO基因功能的报道，而研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以 申请人:对这个基因的部分的外显子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它在免疫方面的功能。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及其应用的技术方案。
[0008]本发明通过以下技术方案实现:
申请人:克隆得到与猪免疫性状相关基因IPlO的DNA片段，它的cDNA序列(包括全长CDS及部分5，-UTR和3，-UTR)如序列表SEQ ID NO:1所述；它的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO:2 所述。
[0009]PCR扩增的IPlO基因cDNA长为787bp，包括CDS全长315bp及部分5’ -UTR和3，-UTR，即如序列表SEQ ID NO:1所述和附图2所示的核苷酸序列。
[0010]PCR扩增的IPlO基因组序列全长为497bp，即如序列表SEQ ID NO:2所述和附图3所示的核苷酸序列。
[0011]在序列表SEQ ID NO:2的第119bp处有一个碱基突变(C119-T119)，该突变导致Msp1-RFLP 多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。
[0012]扩增IPlO基因cDNA序列的引物如下所示:
正向引物序列如SEQ ID N0:5所示，
反向引物序列如SEQ ID N0:6所示。
[0013]扩增IPlO基因测序并检测C119-T119处碱基突变所用的引物序列如下所示:
正向引物序列如SEQ ID N0:3所示，
反向引物序列如SEQ ID N0:4所示。
[0014]本发明所述的分子标记的制备方法是:
用人IPlO基因mRNA(GenBank收录号:NM_001565.3)为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90%以上的表达序列标签(EST);然后对EST进行拼接；与人同源比对并设计引物，提取RNA进行RT-PCR及PCR扩增，并克隆得到如序列表SEQ ID NO:1所示的cDNA序列(包括⑶S全长及部分3’ -UTR);根据与猪IPlO基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物，提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0015]应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO:2所示的第119位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
[0016]更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:本发明的技术流程图。
[0018]图2:本发明中猪IPlO基因部分cDNA序列(包含CDS全长及部分5’ -UTR和3， -UTR)。
[0019]图3:本发明中猪IPlO基因3’_UTR部分序列，其中第119位碱基处的括号内为等位基因的突变位点。[0020]图4:本发明中猪IPlO基因3’_UTR部分序列的扩增序列的电泳图谱，片段大小为497bp (琼脂糖胶浓度为2%)。图中:M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
[0021]图5:本发明中猪IPlO基因测序发现的C119-T19的等位基因突变。
[0022]图6:本发明中猪IPlO基因3’-UTR的Msp1-RFLP的三种基因型(AA AB BB)电泳图谱。M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0024]实施例1
(一)IPlO基因⑶S克隆及部分DNA序列扩增 (I)引物设计
用人IPlO基因mRNA (GenBank收录号:ΝΜ_001565.3 )为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90%以上的ESTs (片段长度大于IOObp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Web/ Search/index, html)查询相应序列，然后用序列分析软件DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据与人IPlO基因mRNA的同源比对初步确定起始与终止密码子位置，设计引物克隆得到如序列表SEQ ID NO:1所示的cDNA序列(包括⑶S全长及部分5’ -UTR和3’ -UTR序列);根据与猪IPlO基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，推测猪IPlO基因含有4个外显子，设计扩增引物，进行PCR扩增、产物纯化及测序，获得如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。其中，通过对外显子IV部分序列(497bp)的扩增测序比对，于119bp处发现了 I个碱基突变(C 119-T 119)，对此突变进行酶切分析，发现该突变恰好影响着内切酶MspI的识别。
[0025]克隆IPlO基因cDNA序列的引物如下所不:正向:5’_ CGGGGGAGACACTCTTCAACT - 3’(该序列如 SEQ ID NO:5 所示)，
反向:5’_ CAGTAGAAGCCCACGGAGTAAAG - 3’(该序列如 SEQ ID NO:6 所示)。
[0026]扩增IPlO基因测序并检测C119-T119处碱基突变所用的引物序列如下所示 正向:5’ - AAGCAGAACTCAGACTGAAACC -3’(该序列如 SEQ ID NO:3 所示)，
反向:5’ - GTAGAAGCCCACGGAGTAAAG -3’(该序列如 SEQ ID NO:4 所示)。
[0027](2) PCR产物的纯化、克隆和测序
PCR扩增条件=IOuL的反应体系中加入DNA模板0.5 μ L, 10,PCR buffer I μ L, dNTP0.3μ L，IOmM引物前后各0.2 μ L，Taq酶1U。PCR反应条件为:94°C预变性5min后，94°C变性30s、61°C退火30s、72°C延伸30s，33个循环，最后72°C延伸5min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0028]PCR产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL离心管中，于65°C温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自TIANGEN公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300 μ L融化的凝胶中加入1mL Resin试剂,混匀20 s,将Resin/DNA混合物转移至带有吸附柱的离心管,离心除去液体。再向吸附柱中加入80%的异丙醇2 mL，离心除去液体，取下吸附柱装入1.5mL离心管中，10，OOOg离心2 min以干燥Resin,将吸附柱装入另一个干净的1.5 mL离心管中，加入30~50 UL灭菌水，静置lmin，10，OOOg离心20s，以洗脱DNA存于离心管中。
[0029]连接反应:将纯化PCR产物与pGEM-T easy载体(购自promega公司)连接,连接反应总体积是5 μ L，其中包括2.5 μ L 2 X Buffer, 0.5 μ L的T载体，1.5 μ L的纯化PCR产物，0.5 UL的Τ4连接酶，置16°C水浴过夜。
[0030]感受态细胞的制备:从37°C培养了 16-20 h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落接种于2 mL LB中，于37°C振荡培养3 h，转接I mL菌液于含有30 mL LB的盐水瓶中，继续在37°C振荡培养约4 h，待0D600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4°C 4，OOOg离心10 min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10 mL冰预冷的0.1 mol/L的CaC12重悬沉淀，冰浴30 min，重复4°C 4, OOOg离心10 min 一次，用4 ml冰预冷的0.1 mol/L的CaC12重悬沉淀，置4°C保存备用。
[0031]转化:无菌状态下取100-120 μ L感受态细胞于1.5 mL离心管中，将5 μ L的连接产物加入混匀，在冰上放置30 min, 420C热激90 S，其间不要摇动离心管，取出后冰浴3_4min，加入400 μ L无抗生素的LB液体培养基，37°C振荡培养45 min。取100 μ L涂布于已提前4 h涂布了 IPTG(英文名称:Isopropylthio_β-D-galactoside,中文名称:异丙基硫代-β -D-半乳糖苷，购自TIANGEN公司和X-gal的琼脂平板上，37°C平放I h后倒置培养。
[0032]质粒的小量制备:挑取平板上的单菌落,接种于2-3mL LB中，37°C 300r/min培养6_8h。用1.5mL离心管12000r/min离心数秒收集菌体。按照质粒小量提取试剂盒说明书步骤进行质粒制备(试剂盒购自OMEGA公司)。
[0033]重组质粒的酶切鉴定:取3 μ L质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为IOyLJpASU限制性内切酶EcoR I及IyL相应的IOX限制性内切酶反应缓冲液(购自Fermetas公司)，轻弹管壁混匀并离心，置37°C水浴1-2小时，取2-3 μ L反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由生工生物工程(上海)有限公司完成。[0034]在本实施例中，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的cDNA序列长度为787bp，包括CDS全长315bp及部分5’ -UTR和3’ -UTR (如图2和序列表SEQ ID NO:1所示)；PCR得到的DNA序列全长为497bp (如图3和序列表SEQ ID NO:2所示)，测序结果表明在该DNA序列的119bp处存在C119-T119突变，测序结果见图5所示。
[0035](3) DNA序列同源性检索鉴定
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)网站的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件,将测序后获得的 DNA 序列与 GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
[0036](二)PCR-RFLP诊断方法建立
RFLP 检测:将 PCR 产物 3 μ L，10 X Buffer I μ L，限制性内切酶 MspI 为 0.2 μ L (2U)，加双蒸水补至10 μ L，将样品混匀后离心，37°C培养箱放置12h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
[0037]用引物扩增猪基因组DNA得到了 497bp特异性扩增片段(详见图4)，序列分析结果表明在119bp处存在C119-T119突变，并导致MspI多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中TT型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有497bp —条DNA带)，CC型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现379bp和118bp两条DNA带)，TC为杂合型(电泳检测时出现497bp、379bp和118bp三条DNA带)。
[0038](三)PCR- MspI 一 RFLP多态性在各猪品种中的分布情况的检测的应用
利用PCR - Msp1- RFLP检测了六个猪种:其中属于中国地方血缘的猪种分别是金华猪，嘉兴黑猪，嵊县花猪和岔路黑猪，属于外来的例如欧美血缘的猪种分别是大白猪和杜洛克猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表1所示，结果显示在地方猪种中等位基因T和C频率无明显差异，在国外猪种中等位基因C占优势。
[0039]表1:几个猪品种中IPlO基因119位点多态性的基因型和基因频率
【权利要求】
1.一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记，其特征在于该核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记，其特征在于该序列中第119位碱基处有一个C119-T119的碱基突变导致RFLP-Jfe/?/多态性。
3.检测如权利要求2所述的碱基突变的引物，其特征在于正向引物序列如SEQID NO:3所示,反向引物序列如SEQ ID N0:4所示。
4.权利要求1或2 所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103898104SQ201410113003
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】潘建治, 黄菁, 朱志伟, 陈晓宇, 于福先 申请人:浙江省农业科学院