一种松江鲈鱼微卫星标记的3重pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，包括（1）松江鲈鱼鳍条基因组DNA提取与稀释；（2）微卫星引物的合成；（3）PCR反应体系及扩增程序优化；(4)PCR产物检测。本发明建立了进行松江鲈鱼亲子鉴定、遗传多样性分析、遗传结构比较的3重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测3个微卫星位点。本发明操作简便快捷、效率高，可以在松江鲈鱼濒危物种保护、种群遗传结构分析、遗传图谱构建、种质鉴定中得到应用。
【专利说明】—种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于松江鲈鱼分子标记领域，特别涉及一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]松江S卢鱼分类地位为鈾形目(Scorpaeniformes)、杜父鱼科(Cottidae)JMlCiA属(Trachidermus)，是一种名贵的暖温性浅水底层鱼类，有降河洄游的习性，为“中国四大名鱼”之一。广泛分布于我国沿海，包括从渤海、黄海到东海的福建厦门等地，但最主要的产区为长江三角洲，历史上松江附近(今上海地区)所产的松江鲈鱼最有名，故得名“松江鲈”。目前，松江鲈鱼已被列入我国重点保护二级水生动物。然而，目前国内对于松江鲈鱼的研究多集中在其繁殖生物学及发育生物学方面，有关遗传学方面的研究相对较少，为更好地保护和利用这一珍稀资源提供珍贵的背景资料，利用微卫星标记来进行松江鲈鱼遗传学方面的研究显得尤为必要。
[0003]微卫星(microsatellite)又称为短串联重复(ShortTandem Repeats, STR)、简单重复序列(Simple Sequence Repeats, SSR),广泛地分布于真核生物的基因组中，每50~150kb左右就会出现一次，鱼类尤以二核苷酸重复如CA、GT最为丰富。由于其分布广泛、符合孟德尔共显性遗传、多态信息含量高、突变快、引物具有通用性强、便于检测等优点，已成为进行遗传连锁图谱的构建、分子进化研究、群体遗传学、家系分析与遗传育种、标记辅助选择以及经济性状的Q TL定位等的主要分子标记之一。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，该方法操作简便快捷、效率高，可以在松江鲈鱼濒危物种保护、种群遗传结构分析、遗传图谱构建、种质鉴定中得到应用。
[0005]本发明的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，包括:
[0006](I)剪取松江鲈鱼的鳍条，提取基因组DNA ；
[0007](2)合成不同位点的微卫星正反向引物，引物序列如下:
[0008]SJL-C47:F: GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
[0009]R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ;
[0010]SJL-B61:F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
[0011]R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
[0012]SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
[0013]R:GGCACATAACGGCTTCACTG ；
[0014](3)运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同松江鲈鱼个体进行3重PCR扩增；
[0015](4)对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定个体的基因型，获得松江鲈鱼遗传多态性图谱。
[0016]所述步骤(3)中的PCR 扩增体系为 10XBuffer5y L，25mM MgCl23 μ L，各含 IOmMdNTPl.0 μ L，IOOng/ μ L 模板 I μ L, SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH208.6 μ L。
[0017]所述10父811打61'中含有2001111 Tris-HCl pH8.825°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,
1.0%Triton X-100。
[0018]所述步骤(3)中的PCR扩增程序为94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性30S，55°C退火30S，65°C延伸Imin，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
[0019]所述步骤(4)中的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测具体为:首先用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色判断产物的有无，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶200V恒电压电泳1.5小时，7.5%的醋酸溶液固定15min，接着用去离子水洗胶3次，每次5min，然后0.15%的硝酸银溶液银染30min,显影2_3min,最后固定5min。 [0020]所述步骤(4)中的确定个体的基因型的方法为:将电泳谱带中的每一条DNA片段作为该位点的一个等位基因来处理，每个位点扩增的等位基因按其迁移率的不同从大到小依次定义为:1、2、3、…、k。由于微卫星标记为共显性标记，在单个位点，纯合子为一条带，杂合子为两条带，统计各样本基因型。
[0021]本发明中所涉及的3个微卫星位点(3几447、5几-861、5几-025)的序列如SEQ IDNO:1-3 所示。
[0022]图1中:1-6为不同的松江鲈鱼个体；图中同时标示出了 3个微卫星位点在不同个体扩增的区间。引物SJL-D25扩增效率最低，在电泳图谱中隐约可见；其次为SJL-B61，电泳图谱相对较清晰；3几447扩增效率最高，每个位点的等位基因均清晰可见。同时，也可以看出SJL-B61仅检测到I个等位基因，不同个体在这个位点没表现出多态性，而其他2个位点在不同个体中都检测到了数量不等的等位基因。标号为I的个体在位点SJL-C47仅检测到一个等位基因，说明该个体在这个位点为纯合子，其余个体均检测到两个等位基因，表明2至6号个体在位点SJL-C47为杂合子；同样，6个不同个体在位点SJL-D25也是纯合子杂合子并存。
[0023]有益.效果
[0024]本发明建立了进行松江鲈鱼亲子鉴定、遗传多样性分析、遗传结构比较的3重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测3个微卫星位点，操作简便快捷、效率高，可以在松江鲈鱼濒危物种保护、种群遗传结构分析、遗传图谱构建、种质鉴定中得到应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为松江鲈鱼3重PCR扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。[0027]实施例1
[0028]1、松江鲈鱼样品采集和DNA制备取松江鲈鱼，剪取鳍条放入95%的酒精保存，剪取鳍条约0.1g用双蒸水冲洗,用滤纸吸干放入1.5mL的离心管,加入465 μ L STE( 150mmol/LNaCl,50mmol/L Tris, lmmol/L EDTA)缓冲液，25 μ L 的 10%SDS，10 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)混匀，55°C消化过夜，用苯酚、氯仿及酚/氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇沉淀，12，OOOr/min离心30min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用50 μ L双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。
[0029]2、松江鲈鱼微卫星标记引物的合成合成不同位点的微卫星正反向引物。 [0030]引物序列如下:
[0031 ] SJL-C47:F:GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
[0032]R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ;
[0033]SJL-B61: F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
[0034]R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
[0035]SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
[0036]R:GGCACATAACGGCTTCACTG。
[0037]3、松江鲈鱼3重PCR扩增运用以上优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同松江鲈鱼个体进行3重PCR扩增。
[0038]松江鲈鱼3 重 PCR 扩增体系:10XBuffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8.825 °C )，IOOmM KCl, IOOmM (NH4)2S04,1.0%Triton X-1OO0 )5 μ L, MgCl2 (25mM) 3 μ L, dNTP(各含IOmM) 1.0μ L，模板(lOOng/μ L) I μ L，SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, TaqDNA 聚合酶(5U/y L) 0.4μ L, ddH208.6 μ L。
[0039]松江鲈鱼3重PCR扩增程序:94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性30S，55°C退火30S，65°C延伸lmin，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
[0040]4、产物检测PCR扩增产物先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中依据条带的亮度判断扩增产物的有无或扩增量的多少，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行不同个体的基因分型。
[0041]4.1准备制胶玻璃板
[0042]用Bind-Silane处理大玻璃板,使凝胶与之粘贴；用Repel-Silane处理小玻璃板，使凝胶易于剥离。通常分离放置两块玻板以免交叉污染，在两块玻板外缘刻划标记以区分未经处理的一面。
[0043]I)用95%乙醇清洗玻璃板。
[0044]2)处理小玻板:加3ml Repel-Silane于小玻板未刻标记的一面，用纸巾将其均匀涂抹在整个表面。室温干燥5min用纸巾擦去多余的Repeo-Silane,去离子水浸泡玻板60min。在去离子水中用纸巾清洗玻板三次,再使之凉干,然后用95%乙醇清洗备用。
[0045]3)处理大玻板:在通风橱中准备Bind-Silane,加I μ I Bind Silane于Iml含5%醋酸的95%乙醇中(50 μ I醋酸加950 μ I乙醇)。充分混合使清澈透亮，全部加到大玻板未刻标记的一面，用抹布均匀涂抹整个表面。室温5min挥干并用95%乙醇清洗3_4次洗去多余的 Bind-Silane。
[0046]4)清洗准备0.4mm间隔条、加样梳和金属夹，将处理好的玻板置于水平制胶模具上，准备制胶。
[0047]4.2配制聚丙烯酰胺凝胶
[0048](8% Acr/Bis Gel/0.4mm)
[0049]40%甲叉双丙烯酰铵(19:1) IOml
[0050]5 X TBE5ml
[0051]去离子水35ml
[0052]在加热磁力搅拌器上使尿素溶解。待尿素溶解后，用0.2μπι滤器过滤凝胶液，灌A 100mL 烧杯。
[0053]然后迅速加入:
[0054]TEMED25 μ I
[0055]10% 过硫酸铵250 μ I
[0056](新鲜配制)
[0057]I)用一支60ml注射器小心将凝胶混合液吸取并加入封好底和边的两块玻板间，让液体自底部向上连续注 入直到液面到达玻板顶端，避免气泡产生。
[0058]2)迅速在顶端两玻板间插入加样梳,并用金属夹固定玻板。
[0059]3)室温使凝胶聚合Ih。
[0060]4.3预电泳
[0061]I)待凝胶聚合好后,去掉金属夹,将凝胶板固定于垂直电泳槽上。
[0062]2)在垂直电泳槽的上下槽分别加入大约500ml0.5XTBE缓冲液。
[0063]3)小心去掉加样梳，用移液器小心冲液加样槽。
[0064]4.4聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0065]I)将3μ I扩增产物加入标记好的微量离心管中(若样本不足3ul，用去离子水补足 3ul)。
[0066]2)加入3 μ I甲酰胺载样缓冲液(95%甲酰胺，0.05%溴酚兰)。
[0067]3)设置等位基因参照物，每份3μ I等位基因加3μ I甲酰胺载样缓冲液。
[0068]4)待凝胶预电泳结束后，用移液器再次冲洗加样槽，然后自左向右依次将样本和ladder加入凝胶加样槽。注意动作要轻柔,避免样品漂移。
[0069]5)恒电压200V电泳1.5小时。
[0070]4.5 银染
[0071]注意事项:
[0072]I)甲醛和冰醋酸可致皮肤和眼睛严重损害，使用时应在通风处以免吸入其挥发气味。并着实验服，戴手套和眼睛防护罩。
[0073]2)碳酸钠、硫代硫酸钠和硝酸银亦可引起皮肤和眼睛刺激反应，使用时应采取防护措施。
[0074]4.5.1试剂配制
[0075]I)在通风橱内配制固定液:(1000ml)
[0076]醋酸75ml
[0077]去离子水925ml
[0078]2)配制银染液(500ml):[0079]硝酸银0.75g
[0080]去离子水500ml
[0081]用前15分钟加入750 μ I甲醛，注意蔽光保存。
[0082]3 )配制显影液(500ml):
[0083]碳酸钠溶液125ml (120g/L)
[0084]硫代硫酸钠溶液500ul (4mg/ml)
[0085]去离子水500ml
[0086]4°C _8°C保存，用前5分钟加750ul甲醛。
[0087]4.5.2银染步骤
[0088]1)电泳结束后，从电泳槽上取下凝胶玻板，小心分离两块玻璃板，凝胶粘附在大玻板上。将大玻板轻轻放入银染盒中。在银染各步操作中，凝胶均应置于旋转摇床上使之缓慢摇动。
[0089]2)加入500ml固定液浸胶15min，剩余固定液保存于4°C到第7步使用。
[0090]3)倒掉固定液,用去离子水洗胶三次,每次500ml,共5min。
[0091]4)倒掉去离子水，加500ml银染液。蔽光，浸胶30min。
[0092]5)将银染液倒入回收容器内。用去离子水快速洗胶10-20s
[0093]6)加500ml显影液。蔽光，浸胶2_3min，直至谱带显出。
[0094]7)倒掉显影液,加入500ml固定液,浸胶5min。
[0095]8)倒掉固定液,将胶板竖立5min,或等玻板干燥。
[0096]9)待凝胶干 燥，谱带将更清晰。
[0097]备注:
[0098]1)从玻板上清除凝胶时可用刀片轻轻刮剔，如果需要，残留凝胶可在10%Na0H中浸泡1h时以彻底清除，最后用95%乙醇和水清洗。
[0099]2)处理硝酸银废液，在回收容器中加入使用过的显影液，过夜，使银离子沉淀，通过滤器过滤银离子悬液，收集银离子结晶，倒掉滤过上清液并用水冲洗。
【权利要求】
1.一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，包括: (1)剪取松江鲈鱼的鳍条，提取基因组DNA； (2)合成不同位点的微卫星正反向引物，引物序列如下:
SJL-C47:F:GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ；
SJL-B61:F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
R:GGCACATAACGGCTTCACTG ； (3)运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同松江鲈鱼个体进行3重PCR扩增； (4)对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定个体的基因型，获得松江鲈鱼遗传多态性图谱。
2.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于:所述步骤(3)中的PCR扩增体系为10XBuffer5y L，25mM MgCl23yL，各含IOmMdNTPl.0 μ L，IOOng/ μ L 模板 I μ L, SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH208.6 μ L。
3.根据权利要求2所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于:所述 IOXBuffer 中含有 200mM Tris-HCl pH8.825°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1.0%TritonX-100。
4.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于:所述步骤(3)中的PCR扩增程序为94°C变性5min后进行下面程序:94°C变性30S，55°C退火30S，65°C延伸lmin，进行30个循环，最后65°C延伸7min。
5.根据权利要求1所述的一种松江鲈鱼微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于:所述步骤(4)中的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测具体为:首先用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色判断产物的有无，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶200V恒电压电泳1.5小时，7.5%的醋酸溶液固定15min，接着用去离子水洗胶3次，每次5min，然后0.15%的硝酸银溶液银染30min,显影2_3min,最后固定5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103937882SQ201410118158
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】张志勇, 张志伟, 徐献明, 许津, 沈德华, 张曹进, 吴建平, 吴国均, 任忠宏 申请人:江苏省海洋水产研究所