酿酒酵母菌株及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种酿酒酵母菌株，其保藏名称为：Saccharomyces?cerevisiae?SC-tri，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年1月12，保藏号：CCTCC?NO：M2014019。该酿酒酵母菌株具有抗木霉菌素的抗性，在含有浓度≤10ppm木霉菌素的培养基上保持正常生长。其拥有与原始酿酒酵母Saccharomyces?cerevisiae一致的基因转化和表达功能。
【专利说明】酿酒酵母菌株及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体地说是一种酿酒酵母菌株。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物 大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。
[0003]因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细胞周期的蛋白、信号蛋白和蛋白质加工酶。酵母为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统。
[0004]木霉菌素来源于紫杉木霉(Zhang et al., 2007; Cardoza et al.，2011)。木霉菌素可有效抑制多种植物病原真菌，影响真核生物蛋白质合成的延伸与终止，是蛋白合成抑制剂。紫杉木霉(Trichoderma taxi)可产木霉菌素(trichodermin),来源于江西官山自然保护区的南方红豆杉。木霉菌素可有效抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、稻痕菌(Magnaporthe oryzae)、终极腐霉(Pythium ultimum)等病原菌指示菌，也可抑制酵母的正常生长。当培养基中木霉菌素的浓度为IOppm时，酵母就无法正常生长。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种新型的酿酒酵母，该酿酒酵母有抗木霉菌素的抗性，能在含< IOppm的木霉菌素的培养基上正常生长。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供一种酿酒酵母菌株:保藏名称为:Saccharomyces cerevisiae SC-tri,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2014年I月12，保藏号=CCTCC NO:M2014019。
[0007]本发明的酿酒酵母有抗木霉菌素的抗性，能在含< IOppm的木霉菌素的培养基上正常生长。
[0008]本发明的酿酒酵母菌株拥有与原始的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 一致的基因转化和表达功能。
[0009]本发明的酿酒酵母具有如下技术优势:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeSC-tri能在含有< IOppm的木霉菌素的培养基上正常生长，具有抗IOppm木霉菌素抗性，并且拥有和原始酿酒酵母菌株一致的基因转化和表达功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0011]图1为酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae对木霉菌素浓度为0.1ppm,lppm, IOppm的生长临界浓度测定结果，表明酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae在0.1ppm和Ippm浓度下可以正常生长，而在IOppm下则表现为不生长。
[0012]图2为酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae对木霉菌素浓度为2ppm，4ppm，6ppm，8ppm，IOppm的生长临界浓度测定，表明酿酒酵母原始菌株Saccharomycescerevisiae在2ppm，4ppm，6ppm和8ppm浓度下可以正常生长，而在IOppm下则表现为不生长。
[0013]图3为酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae (野生型酵母)和突变体酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae SC-tri (紫外诱变得到的酵母)在含木霉菌素IOppm以及Ilppm的SC平板的生长情况，结果表明，酿酒酵母原始菌株Saccharomycescerevisiae无论在IOppm或者Ilppm浓度下均不生长(左上和左下)，而突变体酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae SC-tri在IOppm浓度下生长旺盛(右上)，在Ilppm浓度依然可以生长。
[0014]图4为PCR验证突变体酵母和野生型酵母中tri3基因均已转入的图。
[0015]图5为显微 镜下镜检突变酵母和野生型酵母的生长情况图。
[0016]图6为在培养基上观察突变酵母Saccharomyces cerevisiae SC_tri和野生型酵母的菌落形态图。
【具体实施方式】
[0017]实施例1、原始菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的活化与扩大培养:
[0018]SC培养基配方:0.67%酵母氮源yeast nitrogen base (无氨基酸)，2%葡萄糖glucose，0.01%(腺票呤 adenine，精氨酸 arginine，半胱氨酸 cysteine，亮氨酸 leuine，赖氨酸lysine，苏氨酸threonine，色氨酸tryptophan，尿啼唳uracil)，0.005%(天冬氨酸 aspartic acid,组氨酸 histidine，异亮氨酸 isoleucine，蛋氨酸 methionine，苯丙氨酸 phenylalanine，脑氨酸 proline，丝氨酸 serine，酪氨酸 tyrosine，缴氨酸 valine)，2%琼脂agar (仅用于固体培养基)。
[0019]即，每升SC液体培养基中含有6.7g酵母氮源yeast nitrogen base(无氨基酸)，20g葡萄糖glucose 士則票呤adenine，精氨酸arginine，半胱氨酸cysteine，亮氨酸Ieuinej 赖氨酸 lysine，苏氨酸 threonine，色氨酸 tryptophan，尿啼唳 uracil 各 0.1g ;天冬氨酸 aspartic acid,组氨酸 histidine，异亮氨酸 isoleucine，蛋氨酸 methionine，苯丙氨酸phenylalanine，脑氨酸proline，丝氨酸serine，酪氨酸tyrosine，缴氨酸valine各0.05g ;其余为水(即，用水定容至ID0
[0020]每升SC固体培养基中含有6.7g酵母氮源yeast nitrogen base (无氨基酸)，20g葡萄糖glucose 士則票呤adenine，精氨酸arginine，半胱氨酸cysteine，亮氨酸leuine，赖氨酸lysine，苏氨酸threonine，色氨酸tryptophan，尿啼唳uracil各0.1g ;天冬氨酸 aspartic acid,组氨酸 histidine,异亮氨酸 isoleucine,蛋氨酸 methionine,苯丙氨酸phenylalanine,脑氨酸proline,丝氨酸serine,酪氨酸tyrosine,纟颜氨酸valine各0.05g ；20g琼脂agar ;其余为水。
[0021]试验所用酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae (为常规的酿酒酵母)于酵母甘油管_20°C保藏，使用前需要活化。方法是用18mmX 180mm试管，装5mL的SC液体培养基，接种IOyL~20yL甘油管中的菌液，28 °C过夜培养(即培养8h~10h)。
[0022]实施例2、酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae对木霉菌素的生长临界浓度测定
[0023]含木霉菌素(trichodermin)的SC平板制备:木霉菌素(trichodermin,纯品^ 99.5%，白色颗粒状晶体)溶于丙酮中(浓度为600ppm)，SC固体培养基经微波炉加热融化后，冷却至50-60°C后加入木霉菌素丙酮溶液，直至木霉菌素的终浓度分别为0.1ppm,lppm, IOppm ;倒至直径9cm圆形培养平皿内，其中每皿25ml培养基。
[0024]备注:以下提到的木霉菌素浓度均为在25ml的SC培养基平板上的终浓度。
[0025]上述活化后的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)分别取ImL,对应的涂于含木霉菌素0.lppm, lppm, IOppm的SC平板上,ppm即毫克/升。以不含木霉菌素的平板作为对照，发现仅有含木 霉菌素IOppm的平板上酵母完全未长出。如图1所示，酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae在0.1ppm和Ippm浓度下可以正常生长，而在IOppm下则表现为不生长。于是分别设置木霉菌素浓度为2ppm, 4ppm, 6ppm, 8ppm, IOppm的SC培养基平板，并以不含木霉菌素的SC培养基平皿作为对照，发现仅有含木霉菌素IOppm的平板上没有酵母菌落，如图2所示,酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae在2ppm,4ppm,6ppm和8ppm浓度下可以正常生长，而在IOppm下则表现为不生长。实验结果得到临界浓度IOppm,或者称酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae对木霉菌素的敏感浓度为IOppm,即在IOppm浓度下酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是完全不生长的。
[0026]实施例3、紫外诱变处理
[0027]基于木霉菌素对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的生长具有毒性,在此后基于酵母的转化和表达中会受诸多抑制。我们通过紫外诱变处理，得到一个在木霉菌素抗性临界浓度IOppm下依然生长良好的突变体菌株，具体如下:
[0028]取上述活化后的酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae菌液ImL,涂于含木霉菌素IOppm的SC培养基平板上，将得到的平板分为处理组和对照组，处理组在紫外交联仪，型号H0EFERUVC5000UV crosslinker中紫外处理30s (UV波长:312nm);对照组不经紫外处理。将两组放于培养箱中30°C下培养48h。其中，经过紫外处理的处理组平板上有酵母菌落长出，而对照组中依然没有酵母菌落生长。
[0029]实施例4、突变酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae SC-tri 的鉴定
[0030]处理组其中一个平板上有突变的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC-tri菌落产生，挑取突变酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC_tri菌落，以及酵母原始菌株Saccharomycescerevisiae的菌落，分别在5mL SC液体培养基中，28°C过夜培养(8h~10h)。
[0031]将上述2种活化后的菌液分别进行如下操作:
[0032]取上述活化后的菌液lmL，涂于含木霉菌素IOppm以及Ilppm的SC平板上，将两组分别放于30°C培养箱中培养48h。如图3所示，实验结果表明，酿酒酵母原始菌株无论在IOppm或者IIppm上都不能生长(左上和左下),而经过紫外突变的酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeSC-tri则在含有IOppm的SC平板上正常生长(右上)，在含有Ilppm的SC平板上能生长一部分(右下)，但菌落数明显没有在IOppm木霉菌素的SC平板上生长旺盛，说明通过紫外诱变的突变体酵母菌株，在浓度为IOppm的木霉菌素抗性中已经可以正常生长，其抵抗木霉菌素毒性的能力明显优于其原始菌株。
[0033]将该Saccharomyces cerevisiae SC-tri 进行了保藏；保藏名称为:Saccharomyces cerevisiae SC-tri,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2014年I月12，保藏号=CCTCC NO:M2014019。
[0034]实施例5、 [0035]以紫杉木霉为例，以原始菌株ZJUF0986 (在200710156394.X的专利中有明确告知，保藏号为CGMCC1672)的cDNA为模板，扩增紫杉木霉Tri3基因的编码序列，并将序列片段连接PMD18-T载体，构建载体T-TtTri3。再将T_TtTri3与PYES2载体大量酶切，连接酶切后的片段，构建Tri3基因真核表达载体PYES2-TtTri3。当含基因的质粒PYES2_TtTri3转入酵母细胞，设计引物进行PCR，验证了突变酵母和野生型酵母均能成功转入，如图4所示，说明紫外诱变后的Saccharomyces cerevisiae SC_tri (即，本发明的酿酒酵母菌株)并没有丧失原有的酵母拥有的功能，即对基因的转化和表达上没有任何影响。此外，我们在显微镜下镜检突变酵母和野生型酵母，生长情况一致，生长发育未受到影响(如图5所示):在培养基上观察突变酵母Saccharomyces cerevisiae SC_tri和野生型酵母的菌落形态,如图6显示均一致。综上所述,本发明的Saccharomyces cerevisiae SC_tri拥有与原始酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 一致的基因转化和表达功能；且同时具有抗木霉菌素的抗性。
[0036]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.酿酒酵母菌株，其特征是:保藏名称为:Saccharomycescerevisiae SC-tri,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2014年I月12，保藏号:CCTCC NO:M2014019o
2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株的用途，其特征是:具有抗木霉菌素的抗性。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母菌株的用途，其特征是:在含有浓度<IOppm木霉菌素的培养基上保持正常生长。
4.根据权利要求2或3所述的酿酒酵母菌株的用途，其特征是:拥有与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 一致的基因转化和表达功能。
【文档编号】C12N1/18GK103937693SQ201410120864
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】章初龙, 林福呈, 赵楠, 冯晓晓, 毛黎娟 申请人:浙江大学