小鼠裸卵的体外成熟培养方法
【专利摘要】本发明公开了小鼠裸卵的体外成熟培养方法，包括以下步骤：（1）裸卵的体外成熟培养；（2）成熟裸卵的孤雌激活；（3）成熟裸卵的体外受精。本发明能够创造一个人工模拟卵母细胞自然发生成熟的环境，使裸卵在体外能够高效成熟发育，并且裸卵体外培养成熟后具备同正常发育的卵母细胞一样能够体外受精和胚胎发育。实践证实，该体系裸卵体外成熟发育效率高，体系成熟稳定，裸卵体外自然受精后胚胎发育质量高，因此，本发明能够极大地促进裸卵在人类生殖健康和现代家畜遗传育种中的应用和推广。简化了通过裸卵获得囊胚的操作，为裸卵作为卵源投入到实际生产提供了便利。
【专利说明】小鼠裸卵的体外成熟培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小鼠裸卵的体外成熟培养方法。
【背景技术】
[0002]在正常的生殖发育中，卵母细胞外周包裹有大量的卵丘细胞，自然排卵时，卵母细胞连同外围的卵丘细胞一起排入输卵管内等待同精子结合。在进行胚胎工程操作或辅助生殖技术应用时，卵母细胞外周包裹有大量的卵丘细胞具有成熟效率高，成熟后的卵母细胞具有同精子自然结合形成胚胎的功能。但是，临床应用中从卵巢上直接抽取的卵母细胞中，有一半以上的卵母细胞周围未完全由卵丘细胞包裹，该类卵母细胞成熟效率低，即使能够成熟，成熟后也不具备同精子结合的能力，临床应用中该类卵母细胞常被直接废弃。临床应用中通常把未完全被卵丘细胞包裹的卵母细胞称为裸卵。在生殖发育的科学研究中，裸卵是一种重要的细胞资源用于生殖发育研究，并作为人类辅助生殖健康和现代家畜遗传繁育的一个重要潜在卵源。
[0003]由于卵母细胞周围没有卵丘细胞或较少的卵丘细胞包裹，因此，裸卵是研究卵母细胞生殖发育成熟机制和人造卵母细胞发生的重要试验材料。此前，在世界裸卵的体外发育成熟中，常规的培养体系能够导致卵母细胞进行成熟发育，但是成熟的卵母细胞不具有同精子结合受精的能力，并且体外也不能进一步发育达到子宫着床的囊胚阶段。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠裸卵的体外成熟培养方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:小鼠裸卵的体外成熟培养方法，包括以下步骤:
[0006]取小鼠卵巢，在显微镜下用注射器针头部，刺破卵巢上卵泡，使卵泡中的卵母细胞释放到含HEPES和10%FBS的TCM199卵母细胞体外操作液中，用捡卵针随机把裸卵体外洗涤后，随机分组用补加含50 μ M forskolin的卵母细胞成熟培养液SAGE? In-VitroMaturation Media培养3h后，转移裸卵用补加含2.5 μ M ΗΗ66285的卵母细胞成熟培养液SAGE和 In-Vitro Maturation Media 继续体外培养 16h ；
[0007]其中TCM199为Therma公司产品，培养液产品货号SH30233 ； SAGE^ In-VitroMaturation Media为美国Sage公司产品，培养液产品货号为ART-1600 ；
[0008]( 2 )成熟裸卵的孤雌激活
[0009]取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，转移裸卵至含IOmM SrCl2的CZB培养液中激活培养2.5h，然后激活处理的裸卵至G-1PLUS培养液中进行继续培养，待孤雌激活裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS培养液中继续培养；
[0010]其中CZB培养液的组分为:81.62mM氯化钠+4.83mM氯化钾+1.18mM磷酸二氢钾+1.18mM硫酸镁+1.71mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+31.3mM乳酸钠+ImM谷氨酰胺+0.1mMEDTA+5mg/mlBSA ；[0011]G-1PLUS 培养液和 G-2PLUS 培养液为 Vitrolife Sweden AB 产品，G-1PLUS 培养液货号为10128，G-2PLUS培养液货号为10132 ；
[0012](3)成熟裸卵的体外受精
[0013]取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，用受精液洗涤后，转移到HTF受精液滴中，同时转移获能的精子至成熟裸卵的HTF受精液滴中，体外共同孵育培养，成熟裸卵同获能精子经过6h的共同孵育培养后，在显微镜下挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1PLUS培养液中洗涤后，转移至G-1PLUS培养液中继续，待受精裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS培养液中继续培养；
[0014]其中HTF受精液的组分为:101.6mM氯化钠+4.69mM氯化钾+0.37mM磷酸二氢钾+0.2mM硫酸镁+2.04mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+21.4mM乳酸钠+0.33mM丙酮酸钠+2.78mM葡萄糖+4mg/ml BSA。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]通过研究发现，本体系能够创造一个人工模拟卵母细胞自然发生成熟的环境，使裸卵在体外能够高效成熟发育，并且裸卵体外培养成熟后具备同正常发育的卵母细胞一样能够体外受精和胚胎发育。实践证实，该体系裸卵体外成熟发育效率高，体系成熟稳定，裸卵体外自然受精后胚胎发育质量高，因此，该发明能够极大地促进裸卵在人类生殖健康和现代家畜遗传育种中的应用和推广。简化了通过裸卵获得囊胚的操作，为裸卵作为卵源投入到实际生产提供了便利。 【具体实施方式】
[0017]I实验方法
[0018]1.1裸卵的体外成熟培养
[0019]取小鼠卵巢，在显微镜下用注射器针头部，刺破卵巢上卵泡，使卵泡中的卵母细胞释放到含HEPES和10%FBS的TCM199卵母细胞体外操作液中，其中TCM199为Therma公司产品，产品货号SH30233 ;用捡卵针随机把裸卵体外洗涤后，随机分组放入含50 μ Mforskolin的卵母细胞成熟培养液SAGE? In-Vitro MaturationMedia中，裸卵在含50μΜforskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3h后，把裸卵在含2.5 μ M PD166285的卵母细胞成熟培养液 SAGE?'1 In-Vitro Maturation Media 中洗涤后，转移至含 2.5 μ M PD166285的卵母细胞成熟培养液SAGE? In-Vitro Maturation Media中继续体外培养16h。其中SAGE? In-Vitro Maturation Media为美国Sage公司产品，培养液产品货号为ART-1600。
[0020]1.2成熟裸卵的孤雌激活
[0021]取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，转移裸卵至含IOmM SrCl2的CZB培养液中激活培养2.5h，然后激活处理的裸卵至G-1PLUS培养液中进行继续培养，待孤雌激活裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS培养液中继续培养。其中G-1PLUS培养液和 G-2PLUS 培养液为 Vitrolife Sweden AB 产品，G-1PLUS 培养液货号为 10128，G-2PLUS培养液货号为10132 ;另外CZB培养液的组分为:81.62mM氯化钠+4.83mM氯化钾+1.18mM磷酸二氢钾+1.18mM硫酸镁+1.71mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+31.3mM乳酸钠+ImM谷氨酰胺 +0.1mM EDTA+5mg/ml BSA。[0022]1.3成熟裸卵的体外受精
[0023]取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，用受精液洗涤后，转移到HTF受精液滴中，同时转移获能的精子至成熟裸卵的HTF受精液滴中，体外共同孵育培养，成熟裸卵同获能精子经过6h的共同孵育培养后，在显微镜下挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1PLUS培养液培养液中洗涤后，转移至G-1PLUS培养液培养液中继续，待受精裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS培养液培养液中继续培养。
[0024]2 结果
[0025]小鼠裸卵分别经过含50μΜ forskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3h和含
2.5 μ M PD166285的卵母细胞成熟培养液中成熟培养16h后，小鼠裸卵呈现生发泡破裂，第一极体排出，成熟的裸卵边界清晰，细胞胞质均匀，形态良好。裸卵体外成熟率为75.71%。
[0026]成熟的裸卵孤雌激活后，裸卵能够继续发育形成胚胎，胚胎发育形态正常，胚胎卵裂球细胞均一一致。裸卵孤雌激活率为42.65%，激活发育形成的胚胎经过继续培养后，能够发育形成囊胚，孤雌胚胎的囊胚率为18.33%。在实验的对照组中，未经过含50 μ Mforskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3h和含2.5 μ MPD166285的卵母细胞成熟培养液中成熟培养的裸卵也能够孤雌激活，其孤雌激活率为36.19%，但孤雌激活后的裸卵发育能力较差，没有孤雌激活后的裸卵能够发育形成囊胚。[0027]经过药物处理培养成熟的成熟裸卵，在体外能够同小鼠精子结合，形成受精卵，受精卵能够正常发育形成胚胎。受精后的胚胎在各个发育阶段培养形态良好，卵裂球细胞对称均匀边界清晰，裸卵体外受精率为17.03%。来源于裸卵的受精卵在体外继续培养4天后，来自裸卵的胚胎能够发育形成囊胚，囊胚率为5.65%。在实验的对照组中，未经过含50 μ Mforskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3h和含2.5μ M ΗΗ66285的卵母细胞成熟培养液中成熟培养的裸卵，能够成熟和排出第一极体，但在体外受精过程中不能同精子结合和受
不目ο
[0028]以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【权利要求】
1.小鼠裸卵的体外成熟培养方法，其特征在于包括以下步骤: 取小鼠卵巢，在显微镜下用注射器针头部，刺破卵巢上卵泡，使卵泡中的卵母细胞释放到含HEPES和10%FBS的TCM199卵母细胞体外操作液中，用捡卵针随机把裸卵体外洗漆后，随机分组用补加含50 μ M forskolin的卵母细胞成熟培养液In-Vitro MaturationMedia培养3h后，转移裸卵用补加含2.5 μ M PD166285的卵母细胞成熟培养液In-VitroMaturation Media 继续体外培养 16h ； (2)成熟裸卵的孤雌激活 取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，转移裸卵至含IOmM SrCl2的CZB培养液中激活培养2.5h，然后激活处理的裸卵至G-1PLUS培养液中进行继续培养，待孤雌激活裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS培养液中继续培养；所述CZB培养液的组分为:.81.62mM氯化钠+4.83mM氯化钾+1.18mM磷酸二氢钾+1.18mM硫酸镁+1.71mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+31.3mM乳酸钠+ImM谷氨酰胺+0.1mM EDTA+5mg/ml BSA ； (3)成熟裸卵的体外受精 取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，用受精液洗涤后，转移到HTF受精液滴中，同时转移获能的精子至成熟裸卵的HTF受精液滴中体外共同孵育培养，成熟裸卵同获能精子经过6h的共同孵育培养后，在显微镜下挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1PLUS培养液中洗涤后，转移至G-1PLUS培养液中继续，待受精裸卵发育至8-细胞胚胎阶段时，转移胚胎至G-2PLUS2培养液中继续培养；所述HTF受精液的组分为:101.6mM氯化钠+4.69mM氯化钾+0.37mM磷酸二氢钾+0.2mM硫酸镁+2.04mM氯化钙+25mM碳酸氢钠+21.4mM 乳酸钠 +0.33mM 丙酮酸钠 +2.78mM 葡萄糖 +4mg/ml BSA。
【文档编号】C12N5/075GK103898048SQ201410120868
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】卞雅妮, 曹鸿国, 章孝荣, 张飞, 魏超, 李运生, 刘亚, 张运海, 方富贵 申请人:安徽农业大学