燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用，该燕窝酸醛缩酶突变体由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第25位及第275位的至少一个突变。本发明通过对燕窝酸醛缩酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的燕窝酸醛缩酶突变体。并且该突变体以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物具有比亲本高出至少50%的燕窝酸醛缩酶催化活性。从而使该燕窝酸醛缩酶突变体可用于生产燕窝酸(唾液酸)，降低了生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。
【专利说明】燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学与生物【技术领域】，尤其涉及一种燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]燕窝酸(英文名:Sialic acid)又称唾液酸或N-乙酰神经氨酸，其结构如下图所示，是一类广泛存在于生物系统中的天然糖类化合物，在生命体许多重要的生理、生化反应过程中发挥着不可或缺的作用。N-乙酰神经氨酸(燕窝酸)的结构如图1所示。
[0003]燕窝酸是中国传统珍稀食品燕窝中具生物活性的主要成份，也是母初乳中对婴儿早期大脑发育及免疫体系的完善所提供的重要组份之一。由于燕窝中有高含量的燕窝酸，所以有报道将燕窝酸检测用于燕窝产品质控评析。
[0004]大量的科学研究发现，燕窝酸具有许多十分重要的生物学功能。人类脑细胞中的燕窝酸含量是其它动物的2倍或以上，这或许是人类大脑的智力远高于其他所有动物的物质基础。人类神经细胞膜的燕窝酸含量是身体其它细胞的很多倍，显然，燕窝酸是神经细胞信息传递的重要物质。为证实燕窝酸对于儿童智力发展的重要作用，新西兰的一组科学家曾对超过1000名受试儿童进行从出生到高中毕业为期18年的跟踪研究，发现燕窝酸可提高儿童早期智力发展水平。研究结果表明:母乳喂养的儿童在IQ测试、标准测试、教师评价以及在中学时期的综合表现的分数均高于非母乳喂养的儿童。由于非母乳喂养初生婴儿，其所摄入的燕窝酸比母乳喂养要少20%，母乳喂养时间越长，儿童的综合智力发展水平分数越高。因此，科学家们得出如下结论:对婴幼儿补充燕窝酸，可以增加大脑中燕窝酸的浓度并提闻大脑的学习能力，从而提闻大脑的学习能力。
[0005]此外，燕窝酸的 其它主要功能有:随年龄的增长，红血细胞表面的燕窝酸含量逐步下降。红血细胞表面燕窝酸含量的下降使细胞易被降解，从而加速衰老过程，故燕窝酸可用于抗衰老。人体表皮细胞的燕窝酸具有抗菌作用。燕窝酸可保护皮肤抵抗细菌感染，故燕窝酸可用于护肤。
[0006]研究还发现:酗酒者红血细胞的燕窝酸含量明显低于正常人。因此，酗酒者面色蜡黄，皮肤干燥而无色泽。而在介酒后一星期，其红血细胞的燕窝酸含量与正常人无差别。所以，燕窝酸与人的容颜有关。
[0007]并且燕窝酸及以燕窝酸为母体的药物在国外已应用于临床，可用于治疗流感、神经性疾病、炎症、老年性痴呆症、肿瘤等。
[0008]目前燕窝酸基本上都是通过发酵或合成得到，生产水平较低、不环保、又或是成本较高。微生物发酵法生产燕窝酸时，通常先产生聚燕窝酸，聚燕窝酸再进行酸水解或酶水解后，分离纯化得到燕窝酸。发酵法生产燕窝酸的主要缺点是:发酵产率低及纯化较困难。化学法生产燕窝酸是采用N-乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸的钾盐缩合，再在碱的催化下脱羧作用可生成N-乙 酰神经氨酸；又或在酸性醇溶液中，在铟的催化下，对N-乙酰甘露糖胺用A-溴甲基丙烯酸进行丙烯基化，再进行臭氧分解得到N-乙酰神经氨酸。化学法生产燕窝酸化学法生产燕窝酸得率不高，又不环保。燕窝酸也可从天然产物中提取，如Lekh等从禽蛋的卵带和蛋黄膜中提取燕窝酸，冯万样、高剑峰等人从猪血中提取燕窝酸。由于燕窝酸在天然原料中含量比较低，分离提纯过程也比较复杂，所以回收率低，并造成较大的环境污染。酶法生产燕窝酸具有转化率高、提取简单、产品纯度高等优点。早在1988年，Simon等人[5]用N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和ATP在燕窝酸醛缩酶的催化下合成N-乙酰神经氨酸。Isafumi等[6]用N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶先将N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺，后者再经燕窝酸醛缩酶制得燕窝酸，实现了燕窝酸经二酶合成，并简化了燕窝酸的纯化工艺。但由于燕窝酸醛缩酶之活力较低，工业规模将N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠转化生产燕窝酸时，转化率低，导致生产成本过高。
[0009]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0010]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用，旨在解决目前酶法生产燕窝酸中燕窝酸醛缩酶催化活力低，转化率低、生产成本高的问题。
[0011]本发明的技术方案如下:
一种燕窝酸醛缩酶突变体，其中，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第25位及第275位的至少一个突变。
[0012]所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其中，所述燕窝酸醛缩酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
[0013]所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其中，所述点突变具体为:所述序列2的第25位的丙氨酸突变为谷氨酸。
[0014]所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其中，所述点突变具体为:所述序列2的第275位的甘氨酸突变为丙氨酸。
[0015]所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其中，所述燕窝酸醛缩酶突变体具有如序列表中序列3或序列4所示的氨基酸序列。
[0016]一种编码如上所述的燕窝酸醛缩酶突变体的基因，其中，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得。
[0017]一种如上所述的燕窝酸醛缩酶突变体的应用，其中，所述燕窝酸醛缩酶突变体用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和三磷酸腺苷二钠为底物制备燕窝酸。
[0018]有益效果:本发明提供一种燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用，通过对燕窝酸醛缩酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的燕窝酸醛缩酶突变体。并且该突变体以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物具有比亲本高出至少50%的燕窝酸醛缩酶催化活性。从而使该燕窝酸醛缩酶突变体可用于生产燕窝酸(唾液酸)，降低了生产成本 ，提高了相应产品的市场竞争力。
【专利附图】
【附图说明】[0019]图1为燕窝酸分子结构示意图。
[0020]图2为燕窝酸醛缩酶亲本与突变体G275A之聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0021]本发明提供一种燕窝酸醛缩酶突变体及其编码基因和应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]本发明提供一种燕窝酸醛缩酶突变体，其中，由序列表中的序列2 (亲本序列)经点突变所得，所述点突变为在该序列的第25位及第275位的至少一个突变。
[0023]另外，所述燕窝酸醛缩酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
[0024]进一步地，所述点突变具体为:所述亲本序列第25位的丙氨酸突变为谷氨酸，和/或者亲本序列第275位的甘氨酸突变为丙氨酸。亲本序列第25位的丙氨酸突变为谷氨酸形成序列表中序列3所示的氨基酸序列。亲本序列第275位的甘氨酸突变为丙氨酸形成如序列表中序列4所示的氨基酸序列。
[0025]本发明还提供一种编码如上所述的燕窝酸醛缩酶突变体的基因的DNA，所述基因的DNA由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得。通过该基因的DNA可转录表达所述的燕窝酸醛缩酶突变体。主要得到的是序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。该燕窝酸醛缩酶突变体 可用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物生产燕窝酸(唾液酸)
所述燕窝酸醛缩酶突变体的制备的大致过程为:首先构建含有亲本燕窝酸醛缩酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本燕窝酸醛缩酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有燕窝酸醛缩酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变，在确定目的片段插入到载体上后，可通过LB培养基筛选，从而获得具高催化活性的燕窝酸醛缩酶突变体。上述描述中，其中，亲本是指来自Escherichia coli BL21 (DE3)的燕窝酸醛缩酶，其核苷酸序列如序列表中序列I所示(参考GenBank NC_012971)，其氨基酸序列如序列2所示(参考GenBank YP_003055660)在上述制备方法中，所采用的载体可以为原核表达载体，如pRSET和pES21等；也可以为克隆载体，如PUC18/19和pBluscript-SK。
[0026]进一步的，所述的燕窝酸醛缩酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，当然也可在原核细胞或真核细胞胞外表达。
[0027]进一步地，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞可以为大肠杆菌。所述真核细胞可以为酿酒酵母或毕赤巴斯德酵母。
[0028]该突变体可以通过Histag纯化方案进行纯化，经酶活测定后发现本发明的燕窝酸醛缩酶突变体具有比亲本高出至少50%的燕窝酸醛缩酶催化活性。
[0029]另外，本发明提供的燕窝酸醛缩酶的较高催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶。当然，还可利用固化技术将本发明燕窝酸醛缩酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。
[0030]在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem., 138:9-37，1984)。
[0031]以下通过具体的实施例对本发明制备的燕窝酸醛缩酶突变体及其性能进行说明。下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
[0032]实施例1
亲本燕窝酸醛缩酶编码基因的扩增与克隆:
根据基因库(GenBank NC_012971)基因序列设计引物EC-F和EC-R。用引物对EC-F和EC-R从Escherichia coli BL21(DE3)中扩增燕窝酸醛缩酶编码基因。
[0033]扩增条件为:20mM Tris-HCl (pH 8.8),10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4,
0.1% Triton X-100,50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM 引物EC-F，400 nM引物EC-R，1.0 U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Escherichia coli BL21 (DE3)菌体，再用无菌水调反应体积至50 ml。
[0034]PCR扩增反应程序为:95°C 3分钟，40圈循环:95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分钟，最后72°C 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A (源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-EC。经DNA测序，确定该被克隆的燕窝酸醛缩酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0035]表1
【权利要求】
1.一种燕窝酸醛缩酶突变体，其特征在于，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第25位及第275位的至少一个突变。
2.根据权利要求1所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述燕窝酸醛缩酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
3.根据权利要求1所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为:所述序列2的第25位的丙氨酸突变为谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为:所述序列2的第275位的甘氨酸突变为丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的燕窝酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述燕窝酸醛缩酶突变体具有如序列表中序列3或序列4所示的氨基酸序列。
6.一种编码如权利要求1-5任一项所述的燕窝酸醛缩酶突变体的基因，其特征在于，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得。
7.—种如权利要求1-5任一项所述的燕窝酸醛缩酶突变体的应用，其特征在于，所述燕窝酸醛缩酶突变体用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和三磷酸腺苷二钠为底物制备燕窝 酸。
【文档编号】C12N9/88GK103881997SQ201410126979
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】傅荣昭 申请人:邦泰生物工程(深圳)有限公司