一种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用，通过设计两条核酸序列作为分子内标物直接加入到液态食品中或其他商品内；运用特定的扩增及检测方法检测内标物的存在与否，以判断该液态食品或商品的真伪。本发明通过设计一定序列的核酸分子作为鉴别商品真伪的分子内标物，在检测鉴别过程中，不需要另外加入引物，避免了其它方法设计扩增引物的麻烦，且不受食品内所含核酸分子的干扰，准确性强，特异性高，特别是反应条件为恒温，减少了对温度的控制等繁琐操作。
【专利说明】—种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于防伪鉴定【技术领域】，尤其涉及一种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用。
【背景技术】
[0002]针对现在的食品，尤其是名贵白酒类、保健品，目前其防伪措施主要从其外包装入手。外包装防伪技术主要包括标识防伪和包装结构防伪两大类:标识防伪主要利用高科技技术将各种标识附着于外包装上，便于消费者识别；包装结构防伪则从包装的构造入手，常见的有一次性破坏包装。然而外包装容易被仿造，且外包装上的标识物具有易被划破、污染或脱落等缺点，这给不法分子留下了可乘之机。许多不法分子在利益的趋势下，制假售假，谋取不法利益。
[0003]传统的外包装防伪技术有许多缺点，针对这一现状，许多研究人员试图将一些特殊物质直接或者间接加入到液态食品内，用以作为商品的身份内标，可以通过检测其内标物来判断商 品的真伪，保护商家和消费者的利益。国内外也有关于这方面的报道，例如国内的一篇专利报道，其将动物、植物、微生物或人工合成的基因组DNA或基因片段加入到白酒内作为其内标物，检测时，用乙醇沉淀法提取加入的DNA，再运用PCR技术进行扩增，最后通过凝胶电泳成像观察扩增产物是否与内标物相符，最终来判断商品的真伪。但是，这种方法的不足之处在于，由于是将核酸分子加入到食品内，PCR扩增技术可能会受到食品内所含核酸分子的干扰，出现假阳性结果，另外，PCR扩增技术的反应温度需要特殊仪器控制，引物设计也很繁琐。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用，旨在解决传统PCR扩增技术等会受到食品内所含核酸分子的干扰、出现假阳性结果，以及扩增引物设计麻烦的问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种用于鉴别物品真伪的分子内标物，包括核苷酸序列I和核苷酸序列2 ;其中，
[0006]所述核苷酸序列I组成为:长度为35~45nt，5’端18~22nt的序列为能形成发卡结构的回文序列，该序列内含有一个限制性内切酶的酶切位点I ;3’端剩余长度的序列不能形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶酶切位点2 ；
[0007]核苷酸序列2组成为:长度为35~45nt，5’端18~22nt序列长度为回文序列，能够形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶的酶切位点I ;3’端剩余长度的序列不能形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶酶切位点2 ；
[0008]所述核苷酸序列I和核苷酸序列2中不能形成回文结构的序列部分互补配对。
[0009]优选地，所述核苷酸序列I和/或核苷酸序列2的5’端18~22nt序列中还含有若干个不同的限制性内切酶的酶切位点。[0010]优选地，所述核苷酸序列I和核苷酸序列2的3’端剩余长度序列中还含有若干个不同的限制性内切酶的酶切位点，且所述核苷酸序列I和核苷酸序列2的3’端剩余长度序列能够互补配对。
[0011]本发明进一步提供了上述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，包括以下步骤:
[0012](1)将权利要求1至3任一项所述核苷酸序列I和核苷酸序列2加入到不同型号、不同批次的物品中；
[0013](2)对所述物品中核苷酸序列I和核苷酸序列2进行恒温扩增；
[0014](3)对扩增产物进行检测，确定物品真伪。
[0015]优选地，在步骤(1)中，所述物品包括食品和其它商品。
[0016]优选地，在步骤(2)中，所述恒温扩增过程包括:当核苷酸序列I和核苷酸序列2存在于反应体系时，两条链中不能形成发卡结构的序列部分会退火相结合，形成一段不完整的双链，之后在聚合酶的作用下补齐形成完整双链DNA，双链DNA分子末端会在较高温度下部分解链，自身会形成链内发卡结构，发卡结构的3’ -末端可以作为引物在聚合酶的作用下会继续合成变长，周而复始，最终生成长链DNA。
[0017]优选地，在步骤(3)中，所述检测的方法包括:凝胶电泳检测、酶标仪产物含量检测以及内切酶酶切鉴定。
[0018]优选地，所述内切酶酶切鉴定包括:根据核苷酸序列I和核苷酸序列2上的酶切位点，用相应的一种或多种限制性内切酶对扩增产物进行特异性酶切，凝胶电泳成像检测酶切产物并鉴别物品真伪。
[0019]本发明克服现有技术的不足，提供一种用于鉴别物品真伪的分子内标物及其应用，通过设计两条核酸序列做为分子内标物直接加入到液态食品或间接附于其他商品上；待需要检验其真伪时，运用特定的扩增及检测方法检测内标物的存在与否，以判断该液态食品或商品的真伪。
[0020]在本发明中，两条核苷酸序列的结构如图1所示；其中，序列I组成:5’端的直线部分为一段序列长度为20nt左右的回文序列，能够形成发卡结构，且序列内部含有一个限制性内切酶的酶切位点(加粗部分)；3’端的破浪线部分为一段长度为20nt的序列，该段序列不能形成发卡结构，且序列内部也含有一个限制性内切酶酶切位点(加粗部分)；该链总长度为40nt左右。序列2组成:5’端的直线部分为一段序列长度为20nt左右的回文序列，能够形成发卡结构，且序列内部含有一个限制性内切酶的酶切位点(加粗部分)；3’端的破浪线部分为一段长度为20nt的序列，该段序列也不能形成发卡结构，且内部也含有一个限制性内切酶酶切位点(加粗部分);序列I和序列2中不能形成发卡结构的序列部分(波浪线部分)能够互补配对，即能够形成如图2所示结构。
[0021]将上述设计的核苷酸序列作为分子内标物进行后续扩增，当两条核苷酸链存在于反应体系时，两条链中不能形成发卡结构的序列部分会退火相结合，形成一段不完整的双链，之后在聚合酶的作用下补齐生成完整双链DNA，双链DNA分子末端会在较高温度下部分解链，自身会形成链内发卡结构，发卡结构的3’末端会作为引物在聚合酶的作用下会继续扩增，这样周而复始，最终生成长链DNA，具体扩增过程如图3所示，此反应在较高的恒定温度下进行。[0022]对上述扩增产物进行检测，具体检测方法有以下几种:
[0023]( 1)扩增产物可以直接用凝胶电泳检测，两条DNA链能够扩增，且扩增产物够多，则会在电泳图中有产物显示。
[0024](2)用酶标仪检测(荧光定量检测)产物含量，有产物生成即表明有目的扩增产物生成。
[0025](3)由于分子内标物的序列组成中含有两种内切酶的酶切位点，所以其扩增产物能够被特异性的内切酶所酶切。检测时可以用一种或两种限制性内切酶对扩增产物进行特异性酶切。如果产物能够被酶切，则表明目的扩增产物的生成，也能够验证商品的真伪。另外，为提高检测的特异性，可以在所设计的核酸序列中加入更多个内切酶的酶切位点，在检测时可以用多种特异性酶进行酶切来鉴别其真伪。酶切结果用凝胶电泳成像检测。酶切过程如图4所不。
[0026]以上三种检测方法中，一般采用第三种方法，这一检测方法最为准确，可靠。
[0027]针对这一方法在实际商品的使用，可以在不同型号、不同批次的商品中加入不同的核酸序列，这样就提高了商品的特异性和保密性，也利于后续对商品真伪的鉴别，特异性和保密性的获得，一般可以通过改变核酸分子中非回文序列部分来实现，但尽量保留回文序列部分以保证核酸分子自身的扩增能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明中用于鉴别物品真伪的分子内标物的核酸序列组成结构示意图；
[0029]图2是本发明中分子内标物的两核酸序列在退火后的互补配对的结构示意图；
[0030]图3是本发明中分子内标物的两核酸序列的恒温扩增过程示意图；
[0031]图4是本发明中分子内标物的两核酸序列扩增产物的酶切位点示意图；
[0032]图5是本发明实施例中分子内标物序列B1、B-1在聚合酶作用下的扩增结果示意图；
[0033]图6是为图5中lane2产物经过两种内切酶酶切后的结果示意图。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]实施例
[0036]设计两条核苷酸序列为分子内标物，其中，序列如下所示:
[0037]BI:
[0038]
【权利要求】
1.一种用于鉴别物品真伪的分子内标物，其特征在于，包括核苷酸序列I和核苷酸序列2 ;其中， 所述核苷酸序列I组成为:长度为35~45nt,5’端18~22nt的序列为能形成发卡结构的回文序列，该序列内含有一个限制性内切酶的酶切位点I ;3’端剩余长度的序列不能形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶酶切位点2 ； 核苷酸序列2组成为:长度为35~45nt，5’端18~22nt序列长度为回文序列，能够形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶的酶切位点I ;3’端剩余长度的序列不能形成发卡结构，该序列内部含有一个限制性内切酶酶切位点2 ； 所述核苷酸序列I和核苷酸序列2中不能形成回文结构的序列部分互补配对。
2.如权利要求1所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物，其特征在于，所述核苷酸序列I和/或核苷酸序列2的5’端18~22nt序列中还含有若干个不同的限制性内切酶的酶切位点。
3.如权利要求1或2所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物，其特征在于，所述核苷酸序列I和/或核苷酸序列2的3’端剩余长度序列中还含有若干个不同的限制性内切酶的酶切位点，且所述核苷酸序列I和核苷酸序列2的3’端剩余长度序列互补配对。
4.权利要求1至3任一项所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)将权利要求1至3任一项所述核苷酸序列I和核苷酸序列2加入到不同型号、不同批次的物品中； (2)对所述物品中加入的核苷酸序列I和核苷酸序列2进行恒温扩增； (3)对扩增产物进行检测，确定物品真伪。
5.如权利要求4所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述物品包括液态食品和其它商品。
6.如权利要求5所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述恒温扩增过程包括:当核苷酸序列I和核苷酸序列2存在于反应体系时，两条链中不能形成发卡结构的序列部分会退火相结合，形成一段不完整的双链，之后在聚合酶的作用下补齐生成完整双链DNA，双链DNA分子末端会在较高温度下部分解链，自身会形成链内发卡结构，发卡结构的3’末端可以作为引物在聚合酶的作用下会继续合成变长，周而复始，最终生成长链DNA。
7.如权利要求6所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，其特征在于，在步骤(3)中，所述检测的方法包括:凝胶电泳检测、酶标仪产物含量检测以及内切酶酶切鉴定。
8.如权利要求7所述的用于鉴别物品真伪的分子内标物的应用，其特征在于，所述内切酶酶切鉴定包括:根据核苷酸序列I和核苷酸序列2上的酶切位点，用相应的一种或多种限制性内切酶对扩增产物进行特异性酶切，凝胶电泳成像检测酶切产物并鉴别物品真伪。
【文档编号】C12Q1/68GK103898218SQ201410129433
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】梁兴国, 王鹏飞 申请人:中国海洋大学