半乳糖凝集素-3C（Galectin-3C) 抗体融合蛋白的制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种半乳糖凝集素-3C（Galectin-3C)与抗体连接的新型融合蛋白。融合蛋白，其特征在于，蛋白Galectin-3C经由一个或多个氨基酸组成的接头肽（L）连接到抗体重链恒定区（Fc）的片段，其中Galectin-3C、接头肽（L）和抗体重链恒定区（Fc）的片段利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。所述Galectin-3C是Galectin-3N端截断的多肽，能与内源Galectin-3竞争糖基结合位点，从而促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长与转移。本发明用于制备治疗肺癌等癌症的药品。融合蛋白制备方法主要包括：合成编码所述融合蛋白的cDNA序列；将cDNA序列插入工具载体，构建表达载体；将表达载体在宿主细胞中表达和分离纯化表达的融合蛋白。
【专利说明】半乳糖凝集素-3C (Galectin-3C)抗体融合蛋白的制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药【技术领域】，具体涉及一种半乳糖凝集素-3C (Galectin-3C)抗体融合蛋白及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)是一种肿瘤相关蛋白，当细胞处于静止状态时主要位于胞质，当细胞处于增殖状态时则主要位于胞核，其通过非经典途径分泌到胞外组织间隙。Galectin-3广泛分布于各种正常组织和肿瘤细胞，参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞黏附及新生血管形成和肿瘤浸润与转移等(Fukumori et al.DrugResist Updat.2007; Takenaka et al.Glycocinj J.2004)。因此，近年来 Galectin-3成为备受关注的肿瘤诊断和治疗新靶点。研究发现，Galectin-3与恶性肿瘤的发展及预后都密切相关。
[0003]Galectin-3包括三个独特的结构区:(I)含12个氨基酸的短NH2末端，控制着它的靶细胞，(2)富有甘氨酸、酪氨酸和脯氨酸的重复、连续的胶原样物质，作为基质金属蛋白酶的底物，(3)在COOH-末端区,有一个环绕着碳水化合物结合位点的球形结构(Fukumoriet al.Drug Resist Updat.2007)。此亚基折叠成一压紧的球形结构，这一结构中含功能性糖结合区(CRD)。Galectin-3的N端部分在Galectin-3与糖复合物的细胞表面结合时能发挥多种功能。大量研究表明，细胞内Galectin-3可抑制多种物质诱导的凋亡，具有抵抗细胞凋亡的作用。分布于细胞外的Galectin-3能够介导细胞与细胞外基质(ECM)黏附，保护细胞免于凋亡( Nakahara et al.Apoptosis.2005)。肿瘤细胞分泌Galectin-3有助于诱导肿瘤浸润性淋巴细胞中T细胞的凋亡，致使演进中的肿瘤细胞逃逸免疫调节，从而促进肿瘤的增殖。Galectin-3还参与血管形成、与ECM的作用、肿瘤栓塞及肿瘤细胞扩散等肿瘤细胞转移过程中的重要步骤(Takenaka et al.Glycocinj J.2004)。
[0004]Galectin-3能通过N端和C端相互作用而自身联结,其二聚体和多聚体的形成对Galectin-3的抗凋亡活性起了很重要的作用，而Galectin-3的N端具有Galectin-3发挥抗凋亡效应所必需的Ser6磷酸化位点。Galectin-3C是Galectin-3 N端截断的多肽，可溶性重组Galectin-3C保留了 CRD，能与内源Galectin-3竞争糖基结合位点。同时，Galectin-3C由于缺乏N端和Ser6，而不能发生自身联结和磷酸化，从而促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长与转移(John et al.Clin Cancer Res.2003)。John等将35S标记的Galectin-3C (143个氨基酸残基)作用于人乳腺癌原位裸鼠移植模型，Galectin_3C作为Galectin-3的竞争抑制物，可显著抑制小鼠乳腺癌的生长和转移，且无明显毒副作用(John et al.Clin Cancer Res.2003)oMirandola 和Yu等的研究结果表明Galectin_3C能有效抑制多发性骨髓瘤的生长及瘤内血管形成(Mirandola and Yu et al.PLoS One.2011);还能和其他的抗肿瘤药产生协同作用，降低其他药物的抗药性，并首次阐明其机制是阻断NF-kB信号通路(Yu et al.Cancer Res.2012)。Galectin_3C做为蛋白质多肽类药物主要采取肌肉和静脉注射给药，但由于其在血中半衰期短(4小时)需要频繁注射给药(John et al.Clin Cancer Res.2003)。因此寻找方便有效的给药新剂型和新手段，是Galectin-3C应用中亟需解决的问题。
[0005]中国专利(CN201210371948.9，一种半乳糖凝集素_3结合蛋白及其制备和应用)描写了一种半乳糖凝集素-3结合蛋白和其制备，以及半乳糖凝集素-3结合蛋白结合多种细菌的能力。
[0006]中国专利(CN201310181883.6，半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法)、中国专利(CN02828218.3，预诊癌症的方法和试剂盒)和中国专利(CN201210094723.3，一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物)报道了检测血液中Galectin-3浓度的方法和利用Galectin-3浓度进行癌症和肝纤维化以及早期肝硬化的诊断。
[0007]美国塔夫斯大学申请的中国专利(CN200680009189.4，半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用)描写了向患有上皮缺损的哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素-1蛋白、半乳糖凝集素-3蛋白、半乳糖凝集素-7蛋白和/或半乳糖凝集素-8蛋白用于治疗哺乳动物干眼症的方法。[0008]韩国米迪波斯特股份有限公司申请的中国专利(CN200980154402.4，用于预防或治疗神经疾病的包括间充质干细胞或间充质干细胞培养液的组合物)描写了一种利用半乳糖凝集素-3等用于预防和治疗神经疾病的药物组合物。
[0009]中国专利(CN201210220074.7，一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法)和中国专利(CN201210096807.0，一种脐带间充质干细胞生物学效力的检测方法)分别提供了一种通过检测脂肪干细胞表面和脐带间充质干细胞培养上清液中Galectin-3的表达量来判断脂肪干细胞和脐带间充质干细胞免疫抑制能力强弱的检测方法。中国专利(CN200810150084.1，富含半乳糖的改性多糖在制备阻止结肠炎癌变的药物中的应用)描述了一种以Galectin-3为基础的改性多糖,能阻止Galectin-3与其配体的结合,从而达到阻止炎症性肠病尤其是溃疡性结肠炎癌变的目的。
[0010]美国专利(US877790，N-terminally truncated galectin-3 for use intreating cancer)和美国专利(US0218478, Sustained release N-terminally truncatedgalectin-3 and antibodies to galectin-3 carbohydrate ligands for use intreating cancer)都提供了一种N端截断的Galectin-3和/或能与Galectin-3糖基结合位点配体特异性结合的抗体用于治疗癌症。
[0011]但是没有专利涉及Galectin-3C或/和Galectin-3C抗体融合蛋白用于治疗癌症。
[0012]综上所述,虽然Galectin_3C是一种新型Galectin-3抑制剂,非常有希望成为下一代抗肿瘤新药。以往的研究发现它可显著抑制小鼠乳腺癌、多发性骨髓瘤及卵巢癌的生长和转移，但能否有效抑制肺癌的生长尚不明确。另外，由于Galectin-3C在血中半衰期短需要频繁注射给药，给临床研究和应用带来很多不便，非常有必要研究半衰期延长的新剂型。因此，本发明采用重组DNA技术将Galectin-3C与抗体Fe融合成一种长效制剂，并最终开发成治疗肺癌等癌症的新药，以期为临床治疗肺癌提供新的手段与方法。本发明能提高Galectin-3C的生物稳定性与物理稳定性，也能增加Galectin-3C在血液中的半衰期，以提高其生物利用度，具有广阔的应用前景。[0013]参考文献:
Fukumori T,Kanayama H O,Raz A (2007).The role of galectin-3 in cancer drugresistance.Drug Resist Updat.10:101-108.John C M, Leffler H, Kahl-Knutsson B, et al.(2003).Truncated galectin-3inhibits tumor growth and metastasis in orthotopic nude mouse model of humanbreast cancer.Clin Cancer Res.9:2374-2383.Mirandola L, Yu YF, Chui K, et al.(2011).Galectin_3C inhibits tumor growthand increases the anticancer activity of bortezomib in a murine model of humanmultiple myeloma.PLoS One.6 (7):e21811.Epub 2011 Jul 13.Nakahara S, Oka N, Raz A (2005).0n the role of galectin-3 in cancerapoptosis.Apoptosis.10(2):267-275.Takenaka Y, Fukumori T, Raz A (2004).Galectin-3 and metastasis.GlycocinjJ.19: 543-549.Yu YF, Mirandola, L, Marjorie R, et al.(2012).Galectin-3C and bortezomibpotent anticancer activity and inhibition of angiogenesis, chemotaxis, andNF-kB activation in human multiple myeloma.Cancer Res.72 (8,Supplement I):AM2012-2852.美国专利(US877790).Jarvis, GA, John, CM,Leffler, H.N-terminally truncatedgalectin-3 for use in treating cancer.美国专利(US0218478).Jarvis, GA, John, CM, Leff ler, H.Sustained releaseN-terminally truncated galectin-3 and antibodies to galectin-3 carbohydrateligands for use in treating cancer.中国专利(CN201210371948.9)。孙黎，陈骋。一种半乳糖凝集素_3结合蛋白及其制备和应用。实质审查，2014年4月6日。
[0014]中国专利(CN201310181883.6)。华权高，许可，沈鹤霄等。半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法。公开发明，2014年4月6日。
[0015]中国专利(CN02828218.3)。禹希宗。预诊癌症的方法和试剂盒。失效专利，2014年4月6日。
[0016] 中国专利(CN201210094723.3)。董磊。一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物。实质审查，2014年4月6日。
[0017]中国专利(CN200680009189.4)。诺尔加汉?潘吉瓦尼。半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用。实质审查，2014年4月6日。
[0018]中国专利(CN200980154402.4)。梁允瑄，吴元一，蒋锺旭等。用于预防或治疗神经疾病的包括间充质干细胞或间充质干细胞培养液的组合物。实质审查，2014年4月6日。
[0019]中国专利(CN201210220074.7)。刘广洋，朱德琳，刘拥军等。一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法。有效专利，2014年4月6日。
[0020]中国专利(CN201210096807.0)。刘广洋，朱德琳，刘拥军等。一种脐带间充质干细胞生物学效力的检中国专利(CN200810150084.1)。刘莉，梅其炳，孙阳等。富含半乳糖的改性多糖在制备阻止结肠炎癌变的药物中的应用。有效专利，2014年4月6日。[0021]测方法。有效专利，2014年4月6日。
[0022]
【发明内容】
[0023]本发明的目的是提供一种人Galectin_3C与人抗体Fe的融合蛋白，并提供其制备方法，以用于制备治疗人类肺癌等癌症的药品。这种融合蛋白能提高Galectin-3C的生物稳定性与物理稳定性，也能增加Galectin-3C在血液中的半衰期，以提高其生物利用度。Galectin-3C与抗体Fe的融合蛋白国内外未见报道。
[0024]本发明的技术方案是:Galectin_3C是一种蛋白质多肽类药物，需要采取肌肉和静脉注射给药，但由于其在血中半衰期只有4小时，需要频繁注射给药。因此寻找方便有效的给药新剂型和新手段，是Galectin-3C应用中亟需解决的问题。本发明采用重组DNA技术，提供一种人Galectin-3C与人抗体Fe的融合蛋白以增加其在血液中的半衰期。另外在Galectin-3C和抗体Fe中间插入了柔性接头肽以增加其生物稳定性与物理稳定性。由于其稳定性增加，使得更多的融合蛋白分泌到细胞外，表达量增加；也由于其稳定性增加，蛋白降解减少，使得蛋白的纯度提高。这种融合蛋白包含人Galectin-3C和人抗体Fe,其结构特点是:
蛋白Galectin-3C经由一个或多个氨基酸组成的接头肽(L)连接到抗体重链恒定区的片段，其中Galectin-3C、接头肽(L)和抗体重链恒定区的片段利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。
[0025]上述Galectin_3C是Galectin-3 N端截断的多妝，即Galectin-3的羧基端(C端)，或由在所述氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除、取代和/或添加的氨基酸序列组成，含有糖基结合位点。
[0026]上述抗体重链恒定区为重链恒定区全部(CHl-铰链区-CH2-CH3)或重链恒定区Fe片段(铰链区-CH2-CH3)或其一部分，或其组合。
[0027]上述抗体重链恒定区为人抗体IgG重链恒定区，或IgG亚型重链恒定区的部分或组合。
[0028]上述接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是f 8的整数)或者由式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是1~8的整数)表示的氨基酸序列。
[0029]上述接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η (式中η是1~4的整数)或者由式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η (式中η是1~4的整数)表示的氨基酸序列。
[0030]一种上述的人Galectin_3C与人抗体Fe的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤:
①合成编码上述融合蛋白的cDNA序列；
②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体；
③将上述的表达载体在宿主细胞中表达；
④分离纯化表达的融合蛋白。 [0031]进一步的方案是:上述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
[0032]进一步的方案是:上述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等常见表达宿主。[0033]—种上述的Galectin_3C抗体融合蛋白，含有N端截断的Galectin-3,能与内源Galectin-3竞争糖基结合位点,但由于其缺乏Galectin-3的N端和Ser6 ,而不能发生自身联结和磷酸化，从而促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长与转移。所述融合蛋白用于制备治疗人类癌症的药品，尤其是人肺癌的药品。
[0034]本发明有以下优点:这种Galectin_3C抗体融合蛋白能提高Galectin_3C的生物稳定性与物理稳定性，也能增加Galectin-3C在血液中的半衰期，以提高其生物利用度。
[0035]
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为本发明的Galectin_3C抗体融合蛋白的结构示意图，其中IA显示Galectin-3C-L_Fc 的结构，IB 显不 Fc-L-Galectin-3C 的结构。
[0037]【具体实施方式】
[0038]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的描述，但本发明并不限于这些例。
[0039](实施例1)
见图1，本实施例的Galectin-3C抗体融合蛋白，包含人Galectin_3C和人抗体Fe,其结构特点是:蛋白Galectin-3C经由一个或多个氨基酸组成的接头肽(L)连接到抗体重链恒定区的片段，其中抗体重链恒定区的片段、接头肽(L)和Galectin-3C利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接(图1B)。
[0040]优选地，Galectin-3C、接头肽(L)和抗体重链恒定区的片段利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接(图1A)。
[0041]上述Galectin_3C是Galectin-3的N端截断的多肽,即Galectin-3的羧基端(C端)，或由在所述氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除、取代和/或添加的氨基酸序列组成，含有糖基结合位点。
[0042]上述抗体可以包括IgA，IgD, IgE, IgG和IgM的全部类也包括其全部亚型。抗体重链恒定区为除重链可变区以外的区域，可以是抗体重链恒定区全部(CH1-铰链区-CH2-CH3)或重链恒定区Fe片段(铰链区-CH2-CH3)或其一部分，或其组合。
[0043]优选地，上述抗体重链恒定区为人抗体IgG重链恒定区，或IgGl亚型重链恒定区的部分或组合。抗体重链恒定区包括CHl区-铰链区-CH2区-CH3区。更优选地，抗体重链Fe区包括铰链区-CH2区-CH3区。
[0044]本实施例的Galectin-3C抗体融合蛋白，因具有人类来源的IgG，因而除可直接拮抗Galectin-3之外，还可激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。
[0045]上述接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n (式中n是1~8的整数)或者由式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n (式中n是1、的整数)表示的氨基酸序列，η应满足最大程度保证融合蛋白的正确装配和折叠以实现其拮抗Galectin-3的功能。优选地,η是1-4的整数。[0046]本实施例的Galectin_3C抗体融合蛋白的设计与制备如下述。
[0047]①获得Galectin_3C和抗体IgGl重链恒定区Fe的氨基酸序列，设计融合蛋白分子Gal ect in-3C-Linker_Fc [按N端至C端方向排列,其中I inker序列为(Gly4Ser) 6GG],将其N端通过(Gly4Ser) 3连接到Galectin-3C的C端，然后将其融合到人IgGl信号肽C端，再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0048]②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
将测序正确的两段序列通过EcoR I和Xba I双酶切各自连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法，将两个载体按1:1比例共转染CH0-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞。
[0049]③融合蛋白的分离与纯化:
收集培养液上清，按顺序用Protein A亲和层析和S-200 (GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心10 min，留上清。然后上样到用平衡溶液(20 mMTris-Cl+250 mM NaCl, pH 8.0)预平衡的Protein A亲和层析柱，以平衡溶液洗漆5-10个柱体积，然后以洗脱液(0.1 M甘氨酸缓冲液，pH 3.0)洗脱，将包含蛋白的收集液用I MTris-Cl, pH 8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30 kD)将其浓缩，并上样到用平衡液(20 mM组氨酸，150 mM NaCl,pH 6.0)平衡的S-200层析柱。将融合蛋白部分收集。BCA方法进行定量 。SDS-PAGE检测纯度>96%。
[0050]本实施例的Galectin_3C抗体融合蛋白的初步活性检测:
非小细胞型肺癌细胞株(人肺腺癌细胞株A549、肺鳞癌细胞株SK-MES-1和大细胞肺癌细胞株NC1-H460)在含有10% FBS的RPM1-1640培养液中培养(5% CO2, 37 °C)。肺癌细胞增殖用常规MTT法检测。用前述方法所获得的Galectin-3C抗体融合蛋白能够有效抑制肺癌细胞的生长。
[0051]本实施例的Galectin_3C抗体融合蛋白通过药学可接受的载体用于人类,合适的药物载体为本领域熟知，包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有此类载体的融合蛋白通过众所周知的常规方法制备。
[0052]本实施例的Galectin_3C抗体融合蛋白可以通过各种给药途径用于人类,给药途径包括但不限于静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、口服、舌下给药、喷雾等。
[0053]本实施例的Galectin_3C抗体融合蛋白可以应用上述的药物载体,通过上述的给药途径单独使用或者与其它药物合用用于人类。
[0054]综上,本实施例制备的Galectin_3C抗体融合蛋白，含有N端截断的Galectin-3,能与内源Galectin-3竞争糖基结合位点,但由于其缺乏Galectin-3的N端和Ser6 ,而不能发生自身联结和磷酸化，从而促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长与转移。本发明的融合蛋白用于制备治疗人类癌症的药品，尤其是人肺癌的药品。
[0055]以上实施例是对本发明的【具体实施方式】的说明，而非对本发明的限制，有关【技术领域】的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。
【权利要求】
1.一种半乳糖凝集素-3C (Galectin-3C)与抗体连接的新型融合蛋白，其特征在于:蛋白Galectin-3C经由一个或多个氨基酸组成的接头肽(L)连接到抗体重链恒定区的片段，其中Galectin-3C、接头肽(L)和抗体重链恒定区的片段利用肽键以从N末端到C末端的顺序连接。
2.根据权利要求1所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:所述Galectin_3C是Galectin-3 N端截断的多肽，或由在所述氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除、取代和/或添加的氨基酸序列组成，含有糖基结合位点。
3.根据权利要求1所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:所述抗体重链恒定区为重链恒定区全部(CH1-铰链区-CH2-CH3)或重链恒定区Fe片段(铰链区-CH2-CH3)或其一部分，或其组合。
4.根据权利要求1所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:所述抗体重链恒定区为人抗体IgG重链恒定区，或IgG亚型重链恒定区的部分或组合。
5.根据权利要求1所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:所述接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是f 8的整数)或者由式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是1、的整数)表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:所述接头肽(L)含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是f 4的整数)或者由式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (式中η是1~4的整数)表示的氨基酸序列。
7.—种权利要求1~6任一项所述的Galectin-3C抗体融合蛋白的制备方法,其特征在于，包括以下步骤: ①合成编码所述融合蛋白的cDNA序列； ②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体； ③将所述的表达载体在宿主细胞中表达； ④分离纯化表达的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的Galectin-3C抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
9.根据权利要求7所述的Galectin-3C抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等常见表达宿主。
10.一种权利要求1~6任一项所述的Galectin-3C抗体融合蛋白，其特征在于:用于制备治疗人类肺癌等癌症的药品。
【文档编号】C12N15/63GK103880963SQ201410139547
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】包建新, 余跃飞, 楼亚平 申请人:江苏匡亚生物医药科技有限公司, 广州恒泰生物科技有限公司