一种高温环糊精葡萄糖基转移酶基因及其重组表达的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一个高温环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）基因，从嗜热脂肪地芽孢杆菌GeobacilluscaldoxylosilyticusCHB1基因组中扩增得到一个编码CGTase基因cgt，其序列如SEQ?ID?NO：1所示，该基因用表达载体pLLP-OmpA和pEASY-E2-OmpA实现了胞外分泌表达。该重组酶具有环化活性，主产物为α-环糊精和β-环糊精，最适反应温度为60～65℃，在50℃以下和85℃以上条件下酶活性较低。该重组酶适合工业生产α-环糊精和β-环糊精，可以满足食品、医药和化妆品等领域对环糊精的需求。
【专利说明】一种高温环糊精葡萄糖基转移酶基因及其重组表达
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高温环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因cgt以及其原核重组表达。具体地说是一种cgt基因的克隆及其在大肠杆菌中分泌性表达。重组酶可以利用可溶性淀粉为底物生产α-环糊精和环糊精。
【背景技术】
[0002]高温环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是α -淀粉酶家族的重要成员，具有环化、歧化、水解和耦合四种活性。目前的生产中主要应用其环化反应以淀粉为底物生成环糊精。CGTase催化淀粉主要产生三种环糊精:α-环糊精、β -环糊精和Y _环糊精(分别对应着6、7和8个葡萄糖基)。环糊精内部疏水外部亲水的空腔结构可以包裹许多小分子物质从而改善这些物质的理化性质，因而在食品、医药、化妆品、环境等领域应用广泛。
[0003]目前应用的CGTase主要来源于细菌，已发现Bacillus sp、Thermococcus sp多种细菌产CGTase。由于产CGTase野生型菌株产酶量相对较低，生产应用中比较重视重组CGTase酶基因工程菌的研究，目前最常用的CGTase酶表达宿主菌为大肠杆菌，也有报道用真核表达系统毕赤酵母表达该酶。大肠杆菌表达外源基因的优势是表达量大，但也存在重组蛋白易形成包涵体，可溶性差，以及难以实现胞外分泌表达的问题。陈坚等比较了不同信号肽对浸麻油芽孢杆菌来源CGTase在重组大肠杆菌中分泌表达的影响，证明OmpA信号肽能可以有效介导该酶的分泌表达；Montarop Yamabhai发现来源不同的Bacillus sp信号肽能够很好地介导重组基因在大肠菌中的分泌表达。
[0004]本发明克隆得到源自嗜热菌Geobacillus sp的一个CGTase基因，并应用带有OmpA信号肽的表达载体pLLP-OmpA以及pEASY-E2_0mpA对该酶进行了高效分泌表达。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种高温环糊精葡萄糖基转移酶基因及其重组表达，一个源于嗜热菌Geobacillus caldoxy1silyticus CHBl的一个cgt基因，其核苷酸序列包含2136个碱基，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，该基因有完整的环糊精葡糖基转移酶基因cgt开放阅读框，起始密码子ATG,终止密码子TAA,与GenBank中B.stearthermophiIIuscgt232 gene for cyclodextrin glucanotransferase 的同源性最高 2033/2138(95%)。本发明的另一个目的是提供上述cgt基因的编码的高温CGTase，该酶包含711个氨基酸，其中包括一个35个氨基酸的信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，与GenBank中CGTase最高同源性为685/711 (96%)。
[0006]嗜热脂肪地芽胞杆菌菌株(Geobacillus caldoxy1silyticus) CHB1,该菌株已于2013年8月28日在中国典型培养物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC M 2013384，保藏地址为武汉大学。
[0007] 本发明的再一个目的是提供包含本发明的两种重组表达载体pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt。[0008]本发明的又另一个目的是提供包含上述重组表达载体的两个宿主细胞大肠杆菌ToplOF’ 和 BL21 菌株。
[0009]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
一个编码高温环糊精葡萄糖基转移酶的基因，所述基因为cgt基因，其碱基序列如SEQID NO:I 所示。
[0010]如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011 ] 所述重组表达载体为pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,该表达载体含有分泌型表达信号肽OmpA和权利要求1所述cgt基因。
[0012]在两种宿主细胞ToplOF’和BL21中，分别转化入表达载体pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,实现cgt基因在两种宿主细胞中分泌性表达。
[0013]具体方法如下:
首先对该cgt基因进行克隆并测序
Cl)模板制备:取处于对数后期的CHBl菌液ImL于1.5 mL离心管中10000 g离心，用100 ul无菌水悬浮菌体,沸水浴10 min后迅速置于冰上30 min,即制得PCR扩增模板。
[0014](2)引物设计:上游引物为CF:ATGAAAAGATGGCTTTCATTG,下游引物为CR:GTTTTGCCAATTCACTATAAT。 [0015](3)cgt 的PCR扩增:95°C预变性5 min，然后94 °C 50s, 55 °C 50s, 72 °C 2 min 30s,33个循环，最后后延伸10 min，扩增产物连接到pMD19T后测序。
[0016]进一步地针对该基因序列构建表达载体并进行重组表达
(O构建表达载体:从cgt信号肽序列后设计前端引物CGTF:CGCGGATCCAATAAGGTAAATTTTACATCG (BamHl ),后端引物 CGTR:CGGAATTCGTTTTGCCAATTCACTATAAT (EcoRI),以 Geobacillus sp 菌液为模板扩增带有酶切位点的目的基因，扩增产物与PMD19T载体连接后送测序公司测序以确认碱基无突变，得到重组质粒pMD19T-cgt。提取pMD19T-cgt质粒,用BamHl和EcoRl双酶切,胶回收cgt目的片段。提取质粒pLLP-OmpA和质粒pEASY-E2_0mpA，同样用BamHl和EcoRl双酶切后胶回收酶切产物。将双酶切后的目的基因和质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。挑取转化子重新提质粒，双酶切验证为阳性克隆，得到重组表达质粒pLLP-OmpA-cgt 和 pEASY-E2-0mpA_cgt。
[0017](2)重组子获取及诱导表达:将重组质粒pLLP-OmpA-cgt热激转化大肠杆菌化学感受态细胞ToplOF’，将重组质粒pEASY-E2-0mpA-cgt热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21，在Amp抗性LB平板上挑取转化菌落扩大培养，培养物0D_达到0.6时加入终浓度为ImMIPTG诱导表达，表达条件为30 0C, 220 rpm, 10 h ;培养物超速离心获取菌体，PBS悬浮后冰浴超声破碎，超声参数为功率400 W，超声2s，间隔2s，工作80次；分别取破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE采用12 %的分离胶和4 %的浓缩胶，考马斯亮蓝R250染色。
[0018]进一步地检测重组菌的胞外酶活力
(O挑取重组菌单菌落，于50 mL氨苄青霉素浓度为100 mg/L的LB液体培养基(蛋白胨 I %，酵母浸粉 0.5 %，NaCl I %，pH 7.0)中，37 °C，200 rpm 培养过夜；
(2)1 %的接种量将上述种子液接入50 mL氨苄青霉素浓度为100 mg/L的LB培养基中，37 V，200 rpm培养至OD 600达到0.6时加入终浓度为ImM的IPTG，继续培养，每个6 h取样检测胞外酶活性；
(3)检测重组a -CGTase活性，取离心后得到的发酵液上清即粗酶液0.1 mL，加入到装有0.9 ml预先用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)配制的3 % (w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在60 °C下反应10 min后，加入1.0 mL I mo I/L的盐酸溶液终止反应，再加入1.0 ml预先用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)配制的0.1 mmol/L的甲基橙溶液,混匀后于16。(^下保温20 min,在波长505 nm处测定吸光度。根据α-环糊精标准曲线计算出α-环糊精的浓度，一个酶活力单位定义为在上述反应条件下每分钟生成I μ mol的α -环糊精所需的酶量。
[0019]本发明的优点在于:提供了一种高温环糊精葡萄糖基转移酶基因，同时本发明所用于表达该基因的两株重组菌均可实现重组环糊精葡萄糖基转移酶基因的胞外分泌表达。为该酶的工业化生产奠定了基础基础。重组酶作用于可溶性淀粉的主产物为α-环糊精和β -环糊精，因此该酶可用于生产这两种环糊精产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 cgt 基因重组质粒 pLLP-OmpA-cgt。
[0021]图2 cgt 基因重组质粒 pEASY-E2-0mpA_cgt。
[0022]图3 cgt重组菌pLLP-0mpA-cgt/Topl0F’的SDS-PAGE验证,其中泳道M:蛋白标准分子量泳道1:菌株ToplOF’破碎后上清蛋白泳道2:含有质粒pLLP-OmpA空载体的ToplOF’菌株破碎后上清蛋白泳道3:重组菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’未诱导上清蛋白泳道4:重组菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’经IPTG诱导破碎后沉淀蛋白泳道5:重组菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’经IPTG诱导破碎后上清蛋白泳道6:镍柱纯化后的重组CGTase。
[0023]图4 cgt重组菌pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21表达验证，其中泳道M:蛋白标准分子量泳道1:菌株大肠杆菌BL21破碎后沉淀蛋白泳道2:菌株大肠杆菌BL21破碎后上清蛋白泳道3:重组菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21未诱导沉淀蛋白泳道4:重组菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21 未诱导上清蛋白泳道 5:重组菌株 pEASY-E2-0mpA_cgt/BL21 经IPTG诱导破碎后沉淀蛋白泳道6:重组菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21经IPTG诱导破碎后上清蛋白。
[0024]图5 pEASY-E2-0mpA-cgt表达重组酶的最适反应温度。
[0025]图6 α，β和Y环糊精标准品的HPLC峰图。其中峰6.709为α-环糊精，峰7.352为β -环糊精，峰8.267为Y -环糊精。
[0026]图7 pEASY-E2-0mpA-cgt表达CGTase催化可溶性淀粉产物的HPLC峰图，其中峰
6.709为α -环糊精，峰7.352为β -环糊精，峰8.267为Y -环糊精
【具体实施方式】
[0027]实施例1
本实施例说明菌株Geobacillus caldoxy1silyticus CHBl基因组编码的cgt基因的克隆。
[0028]挑取Geobacillus cal doxy 1si lyticus CHBl菌株单菌落接种于CHBl液体发酵培养基(牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氢二钾0.1 %，磷酸二氢钾0.75 %，蒸馏水配制，pH 7.2), 60°C, 180 rpm恒温摇床培养,取对数后期菌液ImL于1.5 mL灭菌的离心管中，1000 g离心,再用100 ul无菌水悬浮菌体,沸水浴10 min后迅速置于冰上30 min,即为扩增cgt所需模板。混合I ul模板，I ul上游引物(CF:ATGAAAAGATGGCTTTCATTG), I ul下游引物(CR:GTTTTGCCAATTCACTATAAT), 25 ul ExTaqMix (包含 Buffer，Taq 酶和 dNTP)，ddH20 补足至50 ul。应用上述反应体系进行PCR扩增，扩增程序为95°C预变性5 min，然后94°C变性50s，55°C退火50s，72°C延伸2 min 30s，共33个循环，最后在于72°C后延伸IOmin。I %的琼脂糖凝胶电泳检测证明扩增得到长约2100 bp的目的片段。琼脂糖凝胶切胶回收后的PCR产物连接于pMD19-T克隆载体，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，转化产物涂布于蓝白筛选固体平板，37 °〇培养过夜，挑取8个白色克隆子于液体LB抗性培养基(蛋白胨1%，酵母浸粉0.5 %，NaCl I %，pH 7.0，氨苄青霉素100 mg/L)，培养基浑浊后提取质粒，将质粒委托测序公司测序，结果表明插入的片段为2136个核苷酸的目的基因，其开放阅读框可以编码含711个氨基酸的蛋白质。
[0029]实施例2
本实施例说明cgt基因表达载体的构建程序。
[0030]本发明应用两种表达载体构建cgt基因的重组质粒，pLLP-OmpA质粒是一个由PL启动子控制的含分泌型信号肽OmpA的一个表达质粒，pEASY-E2-0mpA是一个由T7启动子控制的含有OmpA信号肽的表达质粒，首先应用限制性内切酶BamHl和EcoRl对质粒pLLP-OmpA、pEASY-E2_0mpA进行双酶切，琼脂糖凝胶切胶回收双酶切产物。然后从cgt信号肽序列后设计前端表达引物CGTF:CGCGGATCCAATAAGGTAAATTTTACATCG (BamHl )，后端表达引物 CGTR:CGGAATTCGTTTTGCCAATTCACTATAAT (EcoRI )，扩增体系为 I ul 上游引物 CGTF，I ul 下游引物 CGTR, 25 ul ExTaqMix (包含 Buffer, Taq 酶和 dNTP)，ddH20 补足至 50 ul。扩增程序为95°C预变性5 min,然后94°C变性50s，55°C退火50s，72°C延伸2 min 30s，共33个循环，最后在于72°C后延伸10 min。I %的琼脂糖凝胶电泳检测后琼脂糖凝胶电泳切胶回收cgt基因片段。应用BamHl和EcoRl对目的基因双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，将回收的目的片段分别与双酶切后的pLLP-OmpA和pEASY-E2_0mpA质粒连接，应用T4DNA连接酶连接，目的基因和质粒的摩尔比为10:1，将两种连接产物分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将转化产物涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板，37°C培养过夜，挑取若干单菌落划线于新的氨苄青霉素的抗性平板，用纯化的单克隆进行PCR验证，结果两种重组质粒转化后均获得了阳性克隆，即获得了 cgt基因重组质粒pLLP-OmpA-cgt (图1)和pEASY-E2-0mpA-cgt (图2)，LB液体培养阳性菌落，抽提质粒。
[0031]实施例3
本实施例说明cgt基因重组菌的获得程序。
[0032] 将重组质粒pLLP-OmpA-cgt转化大肠杆菌感受态细胞ToplOF’,将重组质粒pEASY-E2-0mpA-cgt转化大肠杆菌感受态细胞BL21，将两种转化产物涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板，37°C过夜培养，每种平板各挑取6个单菌落转接于液体氨苄青霉素抗性培养基，37°C，200 rpm培养至菌液变浑浊，应用表达引物CGTF和CGTR进行菌液PCR验证，结果证明得到了两种重组大肠杆菌ToplOF’ /pLLP-OmpA-cgt和BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt。分别挑取两种转化子与100mg/L氨苄抗性LB培养基中37°C培养过夜，然后以I %的接种量转接入100 mg/L氨苄抗性LB培养基中，37°C，200 rpm培养至0D600达0.6时加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导，诱导时间为7 h。
[0033]各取8 mL菌液离心，3 mLPBS缓冲液悬浮沉淀，冰浴超声破碎，超声参数为功率400 W，超声2s，间隔2s，工作80次；分别取破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE采用12 %的分离胶和4 %的浓缩胶，考马斯亮蓝R250染色。SDS-PAGE结果表明两种重组大肠杆菌均实现了 CGTase的表达，ToplOF’ /pLLP-OmpA-cgt表达情况见图3，BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt 表达情况见图 4。
[0034]实施例4
本实例说明重组CGTase的胞外分泌表达。
[0035]重组重组CGTase胞外酶活性的定性检测:将两种重组大肠杆菌的种子液按照1%的接种量接种50 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，200 rpm培养，OD600达到0.6时用终浓度ImM的IPTG诱导，25°C继续培养，每隔6 h取ImL菌液，超速离心后取100 ul上清和100 ul 2 %的可溶性淀粉溶液于60°C反应5 min，碘液显色观察淀粉分解活性，发现重组菌ToplOF’/pLLP-OmpA-cgt和BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt均具有胞外降解淀粉的能力，说明二者均实现了胞外表达。
[0036]重组CGTase胞外酶活性的测定:以BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt为例应用甲基橙褪色法检测胞外酶环化反应产α-环糊精的活性。取离心后得到的发酵液上清即粗酶液0.1mL,加入到装有0.9 ml预先用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)配制的3% (w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在60°C下反应10 min后，加入1.0 mL lmol/L的盐酸溶液终止反应，再加入1.0 ml预先用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)配制的0.1 mmol/L的甲基橙溶液，混匀后于16°C下保温20 min，应用酶标仪在波长505 nm处测定吸光度A，设置空白对照吸光度A0，校正吸光度Al (可溶性淀粉+甲基橙溶液)和校正吸光度A2 (酶液+甲基橙溶液)，每个测定值设置三个重复，计算公式Λ A= (AO-A)- (AO-Al)- (Α0-Α2)，根据α -环糊精标准曲线计算出α -环糊精的浓度，一个酶活力单位定义为在上述反应条件下每分钟生成I μ mol的α -环糊精所需的酶量。测定结果显示在诱导至70 h时胞外酶的环化活性达到 12 U。
[0037]实施例5
本实例确定了该重组CGTase酶的温度反应范围。应用上述甲基橙褪色法测定该酶在不同温度下酶活，结果如图5所示。
[0038]实施例6
本实例确定了该重组CGTase酶的反应产物。取适量纯化后的重组酶于3%的可溶性淀粉溶液中，60%反应3h，反应产物用0.22 μ m的微孔滤膜过滤后用HPLC分析产物成分。以α，β和Y三种环糊精标准品作为对照。色谱柱为氨基柱，流动相为60%乙腈，流速为
0.9mL/min，柱温是30度，应用示差折光检测器检测器。检测结果显示α-环糊精的质量比为32.04%, β -环糊精为56.24%，Y -环糊精为11.72%。峰图结果如图6。
【权利要求】
1.一个编码高温环糊精葡萄糖基转移酶的基因，其特征在于:所述基因为Cgt基因，其减基序列如SEQ ID NO:I所不。
2.如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID NO:2所/Jn ο
3.如权利要求1所述基因的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt，该表达载体含有分泌型表达信号肽OmpA和权利要求1所述cgt基因。
4.根据权利要求3所述基因的重组表达，其特征在于:在两种宿主细胞ToplOF’和BL21中，分别转化入表达载体pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,实现cgt基因在两种宿主细胞中分泌性表达。
【文档编号】C12N1/21GK103993026SQ201410148770
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】林新坚, 陈济琛, 贾宪波, 林戎斌, 陈龙军 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所