一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。该菌株是从新鲜的大豆根瘤中分离纯化得到，已于2014年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?NO:M2014083，分类命名为高效固氮大豆根瘤菌（Bradyrhizobium?diazoefficiens）。该菌株应用于四川大豆的生产。本发明的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是一株共生固氮能力强，对四川大豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性较强的优良广谱大豆根瘤菌菌株。并且与四川的主栽豆品种匹配亲和性好，在不同生态区不施氮肥、接种SCAUs46使大豆增产22%以上，与不接种对照的差异达显著水平。
【专利说明】—株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。
【背景技术】
[0002]化学氮肥为提高农作物产量作出了巨大贡献，但生产成本高、利用率低、污染生态环境。生物固氮则成本低、固氮量大、固氮过程持续、无污染，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展，是农业生产节本增效的有效手段。在粮食生产中需要下大力气开发对环境有益的生物固氮技术。根瘤菌-豆科植物固氮体系是生物固氮中效率最高的。豆科植物人工接种根瘤菌是提高作物产量与品质，改善生态环境的一项重要农业措施。接种根瘤菌是国际上公认的生物固氮技术。大豆与大豆根瘤菌的共生体系是生物固氮中的典型代表。大豆与大豆根瘤菌之间的共生作用，是在长期进化中相互作用、互相选择的结果，也是与环境相适应的结果。世界其他种植大豆的国家在应用大豆根瘤菌的技术上有很大的优势。然而，我国是大豆的起源地，种植大豆的历史悠久，根瘤菌与大豆协同进化，使土壤中固氮效率低的土著根瘤菌与大豆品种具有较强的匹配亲和性，从而大大降低了高效固氮根瘤菌接种剂的作用效果。因此研究和掌握根瘤菌和大豆品种匹配性具有重要的实践价值。
[0003]要提高共生固氮作用，可见菌株和大豆品种应是两个根本因素。而根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在根瘤菌的筛选中，需要注意其对应用地区环境的适应能力。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株。因此在根瘤菌选种时，不仅要开展根瘤菌与大豆品种的匹配性组合研究，还必须重视菌剂应用的地域性。
[0004]大豆是中国第四大农作物，深受中国人民的喜爱，食用方式多种多样，用途广泛，是我国重要的粮食作物和油料作物。因此在我国开展优良大豆根瘤菌株筛选和应用技术研究工作非常有意义。东北大豆产区为我国最大大豆产区，黄淮海地区是我国大豆第二大产区，与这最大的两大产区的主栽大豆品种和生态环境匹配的优良菌株的研究相对较多。针对干旱的西北大豆产区，优良大豆根瘤菌的筛选也有报道。针对我国大豆的第一产区:东北产区，杜迎辉等人从黑龙江分离获得一株与东北大豆品种匹配性好且适合东北地区的优良菌株，于2012年6月获准发明专利。针对我国华南酸性土壤，曹桂芹等人为华南缺磷酸性红壤选育了耐酸、耐铝的3个根瘤菌株系，于2007年12月申请了 3个发明专利。但针对南方大豆产区的四川大豆产区的大豆品种和生态环境相匹配的优良根瘤菌研究鲜见报道。
[0005] 四川大豆以前一直属小宗作物，种植零散，产量较低，种植面积较小。近年来，四川大豆生产发展迅猛，出现规模化、大面积连片种植，产量水平大幅度提高，已经成为四川省主要粮食作物之一，播种面积在全国排名第6位。农业部在《种植业发展第十二五规划》(2011— 2015 )中将四川及西南间套食用大豆列入全国三大优势产区之一，国家发改委又将川渝大豆纳入国家十二五主要粮食作物，四川大豆引起了国家及四川省各级政府的重视。四川大豆栽培方式主要是与玉米间、套作种植，占全省大豆种植面积的90%以上。因此，在四川大豆生产中接种匹配的优良根瘤菌，四川大豆的间套作体系对根瘤菌固氮酶活性的“氨阻遏”还能起缓解作用。四川套作大豆主导品种是“南豆12”和“贡选I号”。又四川间套作的大豆主要种植在四川丘陵区，光热资源丰富的攀西地区主要以春大豆或鲜食大豆为主。目前还没有筛选出与四川主栽大豆品种匹配，适合四川不同生态环境的优良大豆根瘤菌。为此，针对四川的主栽品种和种植大豆的主要生态环境进行大豆优良菌株的筛选，充分发挥生物固氮作用，提高生物固氮在生产实践中的应用效果，从而减少化肥的施用，这对于保护生态环境，节约能源资源，推动农业可持续发展具有重要实践价值。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46，其分类命名为高效固氮大豆慢生根瘤菌SCAUs46Bradyrhizobium diazoefficiens SCAUs46,已于 2014 年 3 月 14 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2014083。
[0009]所述的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46应用于四川大豆的生产。
[0010]本发明的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是一株共生固氮能力强，对四川大豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性较强的优良广谱大豆根瘤菌菌株。并且与四川的主栽大豆品种匹配亲和性好，在不同生态区不施氮肥、接种SCAUs46使大豆增 产22%以上，与不接种对照的差异达显著水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46在YMA培养基上的菌落形态。
[0012]图2为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的16rRNA基因序列的系统发育图。
[0013]图3为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的glnI1、atpD、reCA三个持家基因联合构建的系统发育图。
【具体实施方式】
[0014]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0015]实施例1高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的分离、纯化和保存
[0016]从四川省攀枝花市盐边县种植的大豆中，选择健壮植株主根上大且饱满红色的根瘤，将根瘤擦洗干净，带部分根皮采下，用纸吸干并将其放在装有无水氯化钙并覆有脱脂棉的小管中。在实验室将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀后，用95%的乙醇浸泡30s以消除表面张力，接着用0.l%(m/v)的升汞表面消毒5min，再用无菌水冲洗6次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YAM培养基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH2PO40.25g，MgSO4.7Η200.2g, CaCl2.6Η200.lg, NaCl0.lg, 1% (m/v)钥酸钠 2ml, 1% (m/v)硼酸 2ml, 1%(m/v)刚果红2.5ml, pH6.8-7.0，琼脂18~20g，水1000ml)上划线，在28°C的恒温箱中培养。
[0017]待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到15d左右，因慢生根瘤菌需6~15d出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌:(I)加刚果红的YMA培养基上的菌落形态:不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3~5d就长出菌落的为快生根瘤菌,培养6~IOd长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态:对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。
[0018]本实施例的分离纯化得到的菌株SCAUs46为慢生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度高、稍透明，7d左右长出菌落。经革兰氏染色镜检为G_，呈小杆状。
[0019]实施例2高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的回接及匹配性试验
[0020]高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的回接试验用水培法，试验中用的大豆品种是四川的主导品种“南豆12”，在光照室(控温22~24°C，光照强度2700~3000勒克斯，日照时间14h)进行，种植46d收获。与“南豆12”回接成功后再与其他的主栽大豆品种进行匹配性试验，也用水培法进行，试验中用的大豆品种:间套作的另一主栽大豆品种“贡选I号”、春大豆主栽品种“南豆8号”、主栽的鲜食大豆品种“春丰早”。在上述光照室培养I周后，放置在正常光照及温度条件下培养，种植41d收获。定期补充无菌微氮营养液，微氮营养液配方:0.46g硫酸钙，0.075g氯化钾，0.06g硫酸镁，0.03g硝酸钙，0.075g柠檬酸铁，0.136g磷酸氢二钾，1000ml 蒸馏水，Iml微量元素(2.86g硼酸，0.02g钥酸，0.8g硫酸铜，0.22gZnS04硫酸锌，1.81g硫酸锰，加蒸馏水至1000ml)。将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46与上述大豆品种形成不同组合，水培器采用250ml的细颈瓶(医院用的玻璃输液瓶)，以不接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的同品种植株为对照。收获后用大豆植株的根瘤数及植株干重来评价高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的接种效果。回接试验与匹配性试验的菌液培养、种子的催芽、水培器的制作及种植方法是一致的。
[0021](I)菌液培养:将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28 °C培养至对数生长期(约4d左右)。
[0022](2)种子的催芽:选择粒大、饱满的无损伤的大豆种子，用95%酒精浸5min，倒去酒精,加入0.1% (m/v)的升萊溶液表面消毒5min。最后用无菌水清洗4~6次,每次5min。28°C催芽，待主根长到2~3cm左右，须根未长出时播种。
[0023](3)水培器的制作:用250ml的细颈瓶(医院用的玻璃输液瓶)作水培器。先制作无菌微氮营养液，将配制好的无菌微氮营养液注入清洗后的瓶内，瓶口覆盖一层牛皮纸，在瓶口正中央开一小孔(直径约0.6cm),小孔塞上棉花，外罩一层耐高温的塑料薄膜，在121°C温度下灭菌备用。
[0024](4)种植及测定指标:将催芽种子置于无菌培养皿中用菌液浸泡15min，用无菌镊子将种苗的根插入水培器小孔内，每瓶I株，然后每棵种苗再加入菌液1ml，种子周围用原来孔内的棉花塞好，防止尘埃落入瓶内，造成污染。另设不接种处理的同品种植株为对照(CK)0种植时先种CK。各处理重复3次。水培试验结果列于表1。
[0025]表1结果表明，所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46与4个供试大豆品种的匹配亲和性均好，均表现出较好的结瘤能力和共生固氮能力；与不接种根瘤菌的对照相比，高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46能显著提高每个品种大豆的植株干重，比不接种根瘤菌的对照提高22%~40%。可见，所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是与四川大豆品种匹配性好的优良广谱菌株。
[0026]表1高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的水培试验结果
【权利要求】
1.一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUS46，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNO:M2014083。
2.根据权利要求1所述的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的应用，其特征是，应用于四川大豆的生产。
【文档编号】C12N1/20GK103952344SQ201410151901
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】陈远学, 徐开未, 吴永成, 周涛, 崔雅琪, 赵亚妮, 王佳锐 申请人:四川农业大学