一种集成细胞分选及检测的微流控芯片系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种集成细胞分选及检测的微流控芯片系统，该系统包括微流控芯片、高频锁相放大器和处理器，其中微流控芯片由流道层、电极层、基底层和PCB板依次对准封装而成，流道层上设有细胞分选螺旋流道、检测主流道和缩进流道，缩进流道和电极层的平面金属电极对准，在主流道两侧形成液体电极结构；电极层的电极通过PCB板的功率放大电路、I/V转换电路与高频锁相放大器构成差分高频阻抗测量电路实现细胞交流阻抗的差分检测。本发明的系统能够实现对稀有细胞分选与表征功能的整合，提高了细胞检测技术的集成度和准确性，可广泛用于稀有细胞生物学研究、疾病早期诊断与治疗等领域。
【专利说明】一种集成细胞分选及检测的微流控芯片系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及微流控芯片和生物粒子操控、检测领域，具体涉及一种集成螺旋流道惯性分选技术和差分电阻抗测量技术的微流控芯片稀有细胞检测系统。
【背景技术】
[0002]捕捉检测血液、胸水等体液中微乎其微的稀有细胞，有助于疾病的早期诊断与患者的病情监测以及开展个性化治疗。目前，临床上常用的稀有细胞检测方法有免疫细胞化学、流式细胞术、荧光原位杂交及逆转录聚合酶链反应等，这些方法具有各自的优势，但都以稀有细胞表达的生物分子标记物为分析对象，存在操作复杂、样品消耗大、检测效率低以及实验仪器昂贵等共同缺点。结合微流控技术、阻抗分析技术和流式细胞术的微流控阻抗细胞仪，是一种能够实现单细胞连续分析的非标记方法，与上述方法相比，具有样品消耗低、操作简单和处理快速等优势，在细胞的计数、形貌分析和介电性能表征等方面得到了广泛的应用。
[0003]目前已有研究者尝试利用微流控阻抗细胞仪分析检测稀有细胞，并取得初步进展。然而已有的微流控阻抗细胞仪集成度低，通常只包括阻抗测量与表征单项功能模块，没有涉及细胞分选、聚焦等前处理过程，不能实现在体液中直接检测稀有细胞，从而极大限制了稀有细胞检测方法在临床诊断中的应用。且现有微流控阻抗细胞仪的测量频率通常只达到IO7Hz级，能够分析细胞膜电容和细胞质电导率，但无法获取细胞核等内部结构信息。另外，目前研究人员通常采用商业化的阻抗分析仪，限制了细胞检测系统的应用范围，且不易实现微型化与便携式。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种集成细胞分选及检测的微流控芯片系统，该系统集成了螺旋流道惯性分选技术与差分电阻抗测量技术，实现了稀有细胞检测的高通量分选与精确表征功能的有机整合。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
本发明集成细胞分选功能的微流控芯片稀有细胞检测系统包括微流控芯片、高频锁相放大器以及处理器；所述微流控芯片由流道层、电极层、基底层和PCB板依次对准封装而成；其特征在于:所述流道层包括螺旋流道、突扩结构流道、上分支流道、下分支流道、检测主流道以及两对缩进流道；所述的螺旋流道一端为样品入口、所述的螺旋流道另一端为突扩结构，所述突扩结构具有两个出口，所述的两个出口分别与所述的上分支流道和下分支流道连接；所述的下分支流道出口为检测主流道，所述的检测主流道出口为稀有细胞出口 ；所述的上分支流道出口为废液出口，所述上分支流道设置有使废液出口与稀有细胞出口之间流体压力平衡的弯曲结构；所述两对缩进流道对称分布于检测主流道的两侧；
所述电极层包括一对信号施加电极和一对信号传感电极，分别与两对缩进流道相互对准，在检测主流道的两侧形成液体电极结构；所述PCB板的集成电路包括电信号输入接口、功率放大电路、I/V转换电路以及电信号输出接口 ；所述的ΙΛ转换电路包括电流电压转换模块和差分放大模块；所述电信号输入接口与功率放大电路连接，所述的功率放大电路分成两路与所述的一对信号施加电极连接，所述Ι/v转换电路与电信号输出接口连接；所述的I/V转换电路分成两路与所述的一对信号传感电极连接；
所述的高频锁相放大器通过第一输出端与电信号输入接口连接，高频锁相放大器通过第一输入端与电信号输出接口连接；所述高频锁相放大器、电信号输入接口、功率放大电路、信号施加电极依次连接构成激励信号施加电路；所述信号传感电极、Ι/v转换电路、电信号输出接口以及高频锁相放大器依次连接构成差分阻抗信号传感电路。
[0006]所述的高频锁相放大器通过第二输出端与处理器连接。
[0007]进一步地，还包括进样装置、废液收集装置和稀有细胞收集装置；所述进样装置和样品入口连接；所述废液收集装置和废液出口连接；所述稀有细胞收集装置和稀有细胞出口连接。
[0008]与现有技术相比，本发明具有的有益效果是:
利用流体在螺旋流道中的惯性效应和Dean流作用，将稀有细胞和其它细胞聚焦在不同的平衡位置，并通过突扩结构流道分别导入下分支流道和上分支流道，同时，当下分支流道中的稀有细胞运输到检测主流道的液体电极结构时，借助差分阻抗测量电路获取稀有细胞的差分电阻抗信号，得到稀有细胞的体积与内部介电性能等参数信息，采用上述螺旋流道惯性分选技术结构与差 分电阻抗测量技术集成，克服了已有细胞检测方法的集成度低、测量频率低等缺陷，实现对稀有细胞分选与表征功能的有效整合；另外，本系统的芯片结构简单、加工方便，检测过程中无需鞘液、无需复杂的免疫标记预处理，具有操作简单、自动化程度高等优点，可广泛用于稀有细胞生物学研究、疾病早期诊断与治疗等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明集成细胞分选及检测的微流控芯片系统整体结构示意图；
图2为本发明微流控芯片的结构示意图；
图3为本发明螺旋流道中细胞惯性分选的原理示意图；
图4为本发明突扩结构流道处细胞分选的原理示意图；
图5为本发明液体电极结构的局部放大图；
图6为本发明差分交流阻抗测量电路原理示意图。
[0010]图中:11、微流控芯片，12、高频锁相放大器，13、处理器，14、进样装置，15、废液收集装置，16、稀有细胞收集装置，17、微管，111、流道层，112、电极层，113、基底层，114、PCB板，121、电缆线，122、数据线，21、螺旋流道，22、突扩结构流道，23、上分支流道，24、下分支流道，25、检测主流道，28、紧固件，211、样品入口，231、废液出口，251、缩进流道，252、稀有细胞出口，261、信号施加电极，262、信号传感电极，263、导电银胶，264、导电银胶，271、电信号输入接口，272、功率放大电路，273、I/V转换电路，274、电信号输出接口，31、Dean流，32、螺旋流道内壁面，33、螺旋流道内壁面，41、稀有癌细胞，42、血细胞。
【具体实施方式】[0011]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0012]如图1所示，本发明集成细胞分选及检测的微流控芯片系统包括微流控芯片11、高频锁相放大器12、处理器13、样品进样装置14、废液收集装置15和稀有细胞收集装置16。样品进样装置14、废液收集装置15和稀有细胞收集装置16通过微管17与微流控芯片11连接，分别用于细胞样品的进样、废液的收集和稀有细胞的收集。高频锁相放大器12通过电缆线121与PCB板114的集成电路的电信号输入接口 271和电信号输出接口 274分别连接，用于施加高频交流信号(500MHz)和对响应信号进行处理，并通过数据线122将处理后的交流阻抗信号传输到处理器13中，处理器13可以采用计算机。 [0013]如图2，6所示，所述检测系统的微流控芯片11由流道层111、电极层112、基底层113和PCB板114依次对准封装而成。流道层111包括螺旋流道21、突扩结构流道22、上分支流道23、下分支流道24、检测主流道25和两对缩进流道251，螺旋流道21 —端为样品入口 211，样品入口 211通过微管17和样品进样装置连接，螺旋流道21另一端为突扩结构22，突扩结构22具有两个出口，两个出口分别与上分支流道23和下分支流道24连接；下分支流道24出口为检测主流道25，检测主流道25出口为稀有细胞出口 252，稀有细胞出口 252通过微管17和稀有细胞收集装置16连接；上分支流道23出口为废液出口 231，废液出口231通过微管17和废液收集装置15连接，上分支流道23设置有使废液出口 231与稀有细胞出口 252之间流体压力平衡的弯曲结构；两对缩进流道251对称分布于检测主流道25的两侧；电极层112包括一对信号施加电极261和一对信号传感电极262,分别与两对缩进流道251相互对准，在检测主流道25的两侧形成液体电极结构；PCB板114的集成电路包括电信号输入接口 271、功率放大电路272、I/V转换电路273以及电信号输出接口 274 ;所述的I/V转换电路27包括电流电压转换模块和差分放大模块，所述电信号输入接口 271通过铜箔线与功率放大电路272连接，所述的功率放大电路272分成两路通过导电银胶263与所述的一对信号施加电极261连接；所述高频锁相放大器12、电信号输入接口 271、功率放大电路272、信号施加电极261依次连接构成激励信号施加电路；所述I/V转换电路273通过铜箔线与电信号输出接口 274连接；所述的I/V转换电路273分成两路通过导电银胶263与所述的一对信号传感电极262连接；所述信号传感电极262、I/V转换电路273、电信号输出接口 274以及高频锁相放大器12依次连接构成差分阻抗信号传感电路。
[0014]微流控芯片11的基底层113所用材质为透明的聚二甲基硅氧烷、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一种，流道层111所用材质为聚二甲基硅氧烷、玻璃、环氧树月旨、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一种，信号施加电极261和信号传感电极262为完全相同的平面金属微电极，其所用材质为金或钼等。基底层113上电极层112的制作可通过结合光刻技术和磁控溅射技术实现，而流道层111则可利用光刻技术或其他刻蚀技术快速加工得到，为了避免流道内表面对细胞的吸附，采用化学修饰等特定方式对流道表面进行改性。通过设置微结构对准标记，借助紫外/臭氧照射或氧等离子体处理等表面改性技术实现基底层113和流道层111的不可逆键合。PCB板114和基底层113通过紧固件28实现固定。
[0015]下面以血液中稀有癌细胞的分选与表征来阐述本发明微流控芯片系统的工作流程和基本原理。
[0016]本发明微流控芯片系统的主要工作流程:样品进样装置14将稍稀释的全血样品输送至螺旋流道21，细胞在螺旋流道21内承受与细胞尺寸相关的惯性升力和Dean拽力作用，使得大小不同的血细胞42和稀有癌细胞41聚焦在各自的平衡位置上；利用突扩结构流道22在螺旋流道21的末端将血细胞42从样品中分离到上分支流道23，经废液出口 231收集到废液收集装置15，并将稀有癌细胞41导入下分支流道24 ;当稀有癌细胞41沿下分支流道24进入检测主流道25的测量单元时，信号施加电极261、信号传感电极262、功率放大电路272、I/V转换电路273、高频锁相放大器12组成的测量电路对稀有细胞进行差分交流阻抗测量，最后在计算机上对阻抗信号进行降噪和设别，分析获取稀有癌细胞的尺寸和内部介电特性信息。
[0017]如图3所示，细胞在螺旋流道21内的惯性分选原理:在螺旋流道21的弯流道中，流体的运动可在流道剖面和截面方向上进行分解。在流道剖面上，抛物线形的泊肃叶流使得细胞受到指向壁面的剪切诱导惯性升力作用而向流道壁面运动，当细胞靠近壁面时，因细胞自旋而产生的对称尾迹受壁面影响而产生一个指向流道中心的壁面诱导惯性升力，剪切诱导惯性升力和壁面诱导惯性升力统称为惯性升力Fl。在流道截面上，由于流道中心附近流体较壁面附近流体具有更高的流速，离心力和径向压力梯度的不平衡致使流道中心处的流体向外流动，为满足质量守恒，靠近外壁面33处的流体将沿着流道上下底面回流，于是在流道截面上产生两个旋转方向相反的润31 (Dean流),使得流体中的细胞受到Dean拽力Fd作用。可以看出，在流道截面上只有在位置①处细胞所受到的惯性升力Fl和Dean拽力Fd相互抵消达到平衡，因此细胞将聚焦到靠近螺旋流道内壁面32附近。另外，由于惯性升力^和Dean拽力Fd的大小与细胞尺寸相关,最终造成体积较大的稀有癌细胞平衡在更靠近流道内壁面32 处。
[0018]如图4所示，突扩结构流道22处细胞的分选原理:在螺旋流道21的末端，稀有癌细胞41和血细胞42因螺旋流道中的惯性升力Fl和Dean拽力Fd作用，稳定在各自的平衡位置上。当细胞运动至突扩流道22时，流道的拓宽使得细胞受到的壁面诱导惯性升力突然减小，细胞向靠近壁面的方向运动并稳定在新的平衡位置，造成稀有癌细胞41的平衡位置与血细胞42的平衡位置之间的间距变大。在突扩结构流道22的末端，分叉结构将血细胞42导入上分支流道23，将稀有细胞41导入下分支流道24，实现稀有癌细胞41的分选与聚焦。
[0019]如图5所示，分离后的稀有癌细胞41沿下分支流道24进入检测主流道25，并在检测区域进行阻抗测量。在检测区域内，平面金属电极产生的电场沿着缩进流道251传播，在检测主流道25两侧的壁面上形成一个垂直的等势面，如同在壁面上存在一对垂直电极，即形成液体电极结构。液体电极的设计，能够在得到均匀电场分布的同时，极大简化金属微电极的加工。
[0020]如图6所示，差分高频阻抗测量电路由信号施加电极261、信号传感电极262功率放大电路272、I/V转换电路273、高频锁相放大器12组成，其中功率放大电路272和I/V转换电路273集成在PCB板114上。功率放大器272由宽带固定增益放大器THS4303和一系列电阻组成，用于对锁相放大器产生的激励信号进行功率放大。ΙΛ转换电路273包括电流电压转换模块和差分放大电路，所述的电流电压转换模块由宽带固定增益放大器THS4303和电阻组成，用于将信号传感电极262得到的电流信号转换成电压信号，所述的差分放大电路由差分放大器ADA4927和电阻组成，用于对电压信号进行差分运算。高频锁相放大器12产生的高频交流信号(高达500MHz)，通过功率放大器271放大后分成两路施加到信号施加电极261上，当细胞经过液体电极结构时，细胞引起的电流响应信号通过信号传感电极262传送至I/V转换电路273依次进行电压转换和差分运算，并经锁相放大器12处理后传送至计算机，实现细胞交流阻抗的差分检测。采用差分阻抗测量方法，能够直接获取细胞的阻抗信息。得到的细胞阻抗信息与施加交流信号的频率相关，在低频交流信号情况下，细胞膜的电容性阻碍电流通过，细胞可看作绝缘体，阻抗的幅值与细胞体积成比例；而在高频时，细胞膜的阻碍作用下降，交流信号可以穿透细胞膜和细胞内夜，此时得到的阻抗值反映细胞的内部电学性能。
[0021]对于阻抗检测电路获取的细胞阻抗信号，在计算机中利用软件进行降噪、设别和分析处理，得到电阻抗幅值和相位角等信息，结合电学模型完成对细胞体积和电学特性的提取，并绘制细胞性能参数的散点图，完成具有实际意义的统计学分析。
[0022]以上所述，仅 是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。对于任何熟悉本【技术领域】的相关人员来说，在不脱离本发明技术实质的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种集成细胞分选及检测的微流控芯片系统，该系统包括微流控芯片(11)、高频锁相放大器(12)以及处理器(13);所述微流控芯片(11)由流道层(111)、电极层(112)、基底层(113)和PCB板(114)依次对准封装而成；其特征在于:所述流道层(111)包括螺旋流道(21)、突扩结构流道(22)、上分支流道(23)、下分支流道(24)、检测主流道(25)以及两对缩进流道(251);所述的螺旋流道(21) —端为样品入口(211)、所述的螺旋流道(21)另一端为突扩结构(22)，所述突扩结构(22)具有两个出口，所述的两个出口分别与所述的上分支流道(23)和所述的下分支流道(24)连接；所述的下分支流道(24)出口为检测主流道(25)，所述的检测主流道(25)出口为稀有细胞出口(252);所述的上分支流道(23)出口为废液出口(231)，所述上分支流道(23)设置有使废液出口(231)与稀有细胞出口(252)之间流体压力平衡的弯曲结构；所述两对缩进流道(251)对称分布于检测主流道(25)的两侧； 所述电极层(112)包括一对信号施加电极(261)和一对信号传感电极(262),分别与两对缩进流道(251)相互对准，在检测主流道(25)的两侧形成液体电极结构； 所述PCB板(114)的集成电路包括电信号输入接口(271)、功率放大电路(272)、I/V转换电路(273)以及电信号输出接口(274);所述电信号输入接口(271)与功率放大电路(272)连接，所述的功率放大电路(272)分成两路与所述的一对信号施加电极(261)连接；所述I/V转换电路(273)与电信号输出接口(274)连接，所述的I/V转换电路(273)分成两路与所述的一对信号传感电极(262)连接； 所述的高频锁相放大器( 12)通过第一输出端与电信号输入接口(271)连接，高频锁相放大器(12)通过第一输入端与电信号输出接口(274)连接；所述高频锁相放大器(12)、电信号输入接口(271)、功率放大电路(272)、信号施加电极(261)依次连接构成激励信号施加电路；所述信号传感电极(262)、I/V转换电路(273)、电信号输出接口(274)以及高频锁相放大器(12)依次连接构成差分阻抗信号传感电路。 所述的高频锁相放大器(12)通过第二输出端与处理器(13)连接。
2.根据权利要求1所述的集成细胞分选及检测的微流控芯片系统，其特征在于:还包括进样装置(14)、废液收集装置(15)和稀有细胞收集装置(16);所述进样装置(14)和样品入口(211)连接；所述废液收集装置(15)和废液出口(231)连接；所述稀有细胞收集装置(16)和稀有细胞出口(252)连接。
【文档编号】C12M1/34GK103923825SQ201410154420
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】易红, 倪中华, 唐文来, 项楠, 黄笛, 顾兴中 申请人:东南大学