可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用。所述可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶的核苷酸序列为SEQ?ID?No:1或SEQ?ID?No:3。所述重组葡聚糖酶是经过对微生物源基因进行密码子改造和信号肽替换，筛选到适合在动物细胞表达分泌的2个葡聚糖酶基因；经对该两个基因重组改造，获得两个可在动物细胞表达分泌新的重组酶。本发明获得的两个全新的重组β-葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG可在动物细胞表达分泌，具有更宽pH适应性和耐受性，不但可以用于动物饲料酶制剂开发，同时可以用于转基因动物生产。
【专利说明】可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明技术属于生物【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用。
【背景技术】
[0002]葡聚糖属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是由β_1，3和β_1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合体，分子量大约在6500KDa以上，广泛存在于高等植物细胞壁中，在大麦、燕麦胚乳细胞壁中含量高，大麦中β -葡聚糖含量约4%-10%。在小麦、黑麦，玉米，高粱，小米中等禾谷类农作物也有一定含量，β -葡聚糖分按其溶解性分为水溶性和非水溶性两类，其可溶部分可以在动物胃肠道内形成粘性食糜，影响动物内源消化酶扩散，进而影响营养物质消化，不溶解部分是植物细胞壁的主要成分，部分营养物质包埋其中，阻碍消化酶的消化。β -葡聚糖是大麦、燕麦小麦、黑麦，玉米，高粱，小米中主要的抗营养成分。
[0003]β -葡聚糖酶(β -glucanase)可以水解大麦、小麦和黑麦等谷物中的β -葡聚糖，催化裂解β-葡聚糖分子中β_1，3-1，4糖苷键，降解生成小分子寡糖和葡萄糖。不少研究显示，猪，禽小麦，大麦基础日粮中添加β_葡聚糖酶可以提高动物对粗蛋白，能量，AA利用效率，改善动物生产性能，减少畜禽排泄物中的氮、臭气排放(X.Ao, 2010a ； Owusu-Asieduet al.,2012 ；ffillamil et al.，2012)。葡聚糖酶已经成为动物饲料添加剂最常用外源酶制剂，是一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂。但是这些外源消化酶动物自身不能分泌，一直以来都是先利用微生物发酵获得相应的酶，在人工添加饲料中，添加到饲料中的添加剂容易受饲料制粒、膨化、贮存等因素影响，且需要不断添加，效果不理想，成本闻。
[0004]目前,一大批β_葡聚糖酶(β-glucanase)基因已经在各种细菌,真菌成功克隆出来，如 Alicyclobacillus sp.A4CelA4基因(Bai et al., 2010) ,Paecilomyces sp.FLH30来源 PsBgl6A(Hua et al., 2011)基因，(Hua et al.，2011)，Bisporasp.MEY_lBgl7 基因(Luo et al., 2010), B.1icheniformis EGW039egl314 基因(Teng et al., 2006)等。这些基因克隆后，经大肠杆菌或者酵母发酵产酶，根据报道绝大多数酶基因最适PH较窄，在不同PH缓冲液中仅有一个峰，很难适应动物胃肠道PH1.0~7.0持续变化的酸碱环境，在动物胃肠道中仅能在胃或者肠道发挥水解作用，作用时间短，其耐酸碱，耐胃蛋白酶，胰蛋白酶能力参差不齐，其最适作用温度严重偏离动物正常体温，多分布在40-70°C。饲料制粒温度多数要求80-95°C，其实际应用中，对酶耐热能力要求较高，受诸多因素影响，很难选择理想的酶用于生产。
[0005]因此，有必要对β -葡聚糖酶进行改良，以期能适应动物胃肠道环境。
【发明内容】
[0006]基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0008]一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，所述重组葡聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:3 ;所述重组葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2或SEQ IDNo: 4。
[0009]本发明还提供了上述重组葡聚糖酶的重组方法，包括以下步骤:
[0010](I)对微生物来源的葡聚糖酶基因Bgl7A和egl314的成熟肽区密码子进行优化，人工去除基因Bgl7A和egl314自身信号肽序列，将SEQ ID No:5所示的猪腮腺蛋白信号肽序列添加到密码子优化后的Bgl7A和egl314基因成熟肽N端进行基因改造，改造后的基因分别为:SEQ ID No:6所示的pBgA和SEQ ID No:7所示的pEGX ；
[0011](2)、将改造后的基因5 ‘端和3’端分别添加EcoRI和XhoI限制性内切位点后，克隆到PUC57质粒中，再利用EcoRI和XhoI内切酶分别酶切，得到含有改造基因的内切酶片段，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体PCDNA3.1 (+)质粒中，分别获得载体pCDNA-pBgA和pCD-pEGX ；
[0012](3)、去除pEGX基因N端PSP信号肽序列，和pBgA基因C端的终子密码子，借助序列号为SEQ ID No:10的刚性肽A3连接，将pEGX基因连接到pBgA基因C端，并在pEGX基因C末端添加flag-tag标签，得到重组β -葡聚糖酶pBgA3pEG，其核苷酸序列为SEQ IDNo: 1，氨基酸序列为 SEQ ID No:2;
[0013](4)、将步骤(3)获得的重组葡聚糖酶pBgA3pEG克隆到p⑶NA3.1 (+)载体中，获得pCD-pBgA3pEG ;以 pCD-pBgA3pEG 为模板，SEQ ID No: 11 和 SEQ ID No: 12 为引物进行第一次扩增得到pBgA-2A ;然后以步骤(2)中的载体pCD-pEGX为模板，SEQ ID No: 13和SEQ IDNo: 14为引物进行第二次扩增得到2A-pEGX ；
[0014](5)、以 SEQ ID No: 11 和 SEQ ID No: 14 作为引物，以步骤(4)获得的 pBgA_2A 和2A-pEGX为模板，进行基因重叠延伸PCR扩增，获得重组β -葡聚糖酶pBg2ApEG，其核苷酸序列为SEQ ID No:3,氨基酸序列为SEQ ID No:4。
[0015]在其中一些实施例中，步骤⑷和(5)中所述PCR扩增条件为:98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 10 ~20S ；35 个循环；72°C 2min。
[0016]本发明还提供了上述可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶在制备细胞生物反应器或转基因动物中的应用。
[0017]本发明利用基因重组技术，将微生物源的4个葡聚糖酶基因的成熟肽区进行密码子改造，再将信号肽替换为猪腮腺分泌信号肽，筛选到适合在动物细胞表达分泌的2个人工葡聚糖酶基因PBgA和pEGX ;根据单体酶自身pH作用范围狭窄的缺陷，利用基因重叠延伸技术，将两个不同来源但作用PH范围互补的两个酶进行重组融合，获得两个全新的可在动物细胞表达分泌的重组β -葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG，这两个酶具有更宽的pH范围，覆盖动物整个消化道(胃，小肠，大肠)，在动物胃，小肠，大肠等整个肠道都能发挥作用，始终保持较高的活性。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0019]1、本发明获得的两个全新的重组β -葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG可在动物细胞表达分泌，具有更宽pH适应性和耐受性，不但可以用于动物饲料酶制剂开发，同时可以用于转基因动物生产。
[0020]2、本发明获得的两个人工改造β葡聚糖酶基因pBgA和pEGX，具有葡聚糖酶活性，且可在哺乳动物细胞表达分泌，可以用于转基因动物生产中。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例1中载体构建示意图，其中，CMV为CMV启动子，PSP为猪腮腺
蛋白信号；
[0022]图2为本发明实施例1中经密码优化的pCel、ppsBgl6A、pBgA和pEGX酶在PK15细胞的酶活力表达检测图，其中，转染P⑶NA3.1空载体做为对照，数据来源3个生物学重复，数据表示酶活平均值土标准误；
[0023]图3为本发明实施例1中重组葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG的构建示意图；
[0024]图4为本发明实施例1中pBg-2A、2A-pEGX及重组葡聚糖酶pBg2ApEG的酶切鉴定图谱；
[0025]图5为本发明实施例1中重组葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG在PK15细胞的表达检测图；
[0026]图6为本发明实施例2中重组葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG对pH的稳定性试验结果图；其中图6A和B为不同pH缓冲液中两重组酶与单体酶的相对酶活比较；图6C为两种重组酶与两种单体酶的相对酶活比较；
[0027]图7为本发明实施例3中重组葡聚糖酶pBgA3pEG和pBg2ApEG的酶活力比较。【具体实施方式】
[0028]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0029]如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。
[0030]实施例1可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶的重组方法
[0031]包括以下步骤:
[0032]1.候选基因筛选
[0033]根据文献报道，本发明从NCBI筛选4种细菌和真菌来源的葡聚糖酶基因，分别获得来源于 Alicyclobacillus sp.A4 的 CelA4 基因(Bai et al., 2010), Paecilomycessp.FLH30 来源的 PsBgl6A 基因(Hua et al.，2011)，Bisporasp.MEY-1 来源的 Bgl7 基因(Luo et al., 2010) ,B.1icheniformis EGW039来源的 egl314基因(Teng et al.，2006)的全序列，这些基因在细菌和真菌中具有较高的活性。
[0034]2、候选基因优化改造
[0035]利用 Signal P3.0 在线软件(http:1Iwm.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),分别预测四个基因的成熟肽区和信号肽区，接着根据猪密码子偏好性，利用Optimum Gene TMGene Design system软件对微生物来源的基因CelA4、PsBgl6A、Bgl7A和egl314的成熟肽区密码子进行优化。人工去除微生物源基因CelA4、PsBgl6A、Bgl7A和egl314自身信号肽序列，将猪腮腺蛋白信号肽(PSP，60bp，SEQ ID No:5)序列添加到密码优化后的CelA4，PsBgl6A，Bgl7A和egl314基因成熟肽N端进行基因改造。改造后的基因分别命名pCel (SEQID No:8)、ppsBgl6A(SEQ ID No:9)、pBgA(SEQ ID No:6)和 pEGX(SEQ ID No:7)。
[0036]3、优化改造后的基因克隆进哺乳细胞表达载体
[0037]将人工改造密码优化的pCel、ppsBgl6A、psBgA和pEGX基因5 ‘端和3’端分别添加EcoRI和XhoI限制性内切位点，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因完成合成后克隆到pUC57商业质粒(金斯瑞)中保存，分别为pUC-pCel、pUC-ppsBgl6A、pUC-pBgA及pUC-pEGX。
[0038]利用EcoRI (fermentas公司)和XhoI (fermentas公司)内切酶分别酶切pUC-pCel、pUc_ppsBgl6A、pUC-psBgA, pUC-pEGX 质粒，分别获得 EcoR1-ppsBgl6A_xho1、EcoR1-pCel-xho1、EcoR1-pBgA-xhoI 和 EcoR1-pEGX-XhoI 内切酶片段，并将其克隆到哺乳动物细胞表达载体PCDNA3.1(+)质粒(Invitrogen公司)中，获得载体pCD-pCel、pCD-ppsBgl6A、pCDNA-pBgA 和 pCD-pEGX(图1)。
[0039]4、筛选可在哺乳动物细胞表达分泌的葡聚糖酶
[0040]用脂质体Lipofectamine LTX Reagent(Invitrogen 公司)将 pCD-pCel、pCD-ppsBgl6A、pCDNA-pBgA和pCD-pEGX转染猪肾pK15细胞(温氏研究院提供)，72个小时后，收集细胞培养液，参考国家标准《ΝΥΤ911-2004饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法测定》细胞酶活，酶活测定条件:0.8%大麦葡聚糖底物，在39.5°C，水浴反应30min。酶活测定结果见图2，从图2可以看出，p⑶NA-pBgA和p⑶-pEGX与对照相比，葡聚糖酶活力 显著提升。因此，经细胞表达验证，筛选到可在哺乳动物细胞表达分泌的 pBgA (来源于 Bisporasp.MEY-1Bgl7 基因)和 pEGX (来源于 B.1icheniformisEGW039egl314基因)两种葡聚糖酶。且pBgA，pEGX基因的工作pH条件范围具有一定互补性，pBgA工作pH为1.0~5.0, pEGX工作pH为4.0~7.5 (见图6)。
[0041 ] 5、筛选到的葡聚糖酶进行重组
[0042]针对筛选到的单个葡聚糖酶工作pH范围狭窄，对酸碱环境要求苛刻，不能完全适应动物胃肠道PH1.0~6.5环境等缺陷，对葡聚糖酶进行重组，以期得到的重组酶的pH性能能得到优化。
[0043]a、融合β -葡聚糖酶pBgA3pEG的设计和合成
[0044]首先去除pEGX基因N端PSP信号肽序列，和pBgA基因C端的终子密码子，借助猪密码子优化的刚性肽 A3 (GAAGCCGCTGCCAAGGAGGCTGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCTAAG,序列号为SEQ ID No: 10)的连接，将pEGX基因连接到pBgA基因C端，并在pEGX基因C末端添加flag-tag标签，以便于对酶蛋白检测,得到融合β -葡聚糖酶pBgA3pEG(核酸序列为SEQ IDNo: 1，氨基酸序列为SEQ ID N0:2)，最后将pBgA3pEG委托上海金斯瑞生物公司合成。然后克隆到 PCDNA3.1 (+)载体中，获得 pCD_pBgA3pEG(图 3)。
[0045]b、重组β -葡聚糖酶pBg2ApEG设计和构建
[0046]以pCD-pBgA3pEG 为模板，用引物 Fl:A5f ~CCAGTGTGGTGGAATTCTTGTCTT~3，(SEQID No: 11，下划线为 EcoR I )和引物 R2:5 ’ -CCAGCCAATTTCAAGAGAGCATAATTAGTACACTGGTTCCATCCGCCGGATCCTGAG-3’ (SEQ ID No: 12)扩增得到 pBgA_2A (1312bp，酶切鉴定见图 4A)，扩增体系:PrimeSTAR HS (Premix) 25 μ I, Primer Fl lul, PrimerR21ul,模板 50 ~200ng,灭菌蒸馏水补充到50 μ I。然后以pCD-pEGX为模板，用引物F3:5’ -GTTGAGAGCAACCCAGGTCCCATGTTTCAGCTCTGGAAACT-3, (SEQ ID No: 13)和引物 R4:5’ -GGGCCCTCTAGACTCGAGCTCAAGTTTATCATCATCATCCTTGTAATCCTTTTTTGTGTATCGCACCCA-3’ (SEQ ID No: 14，下划线部分为 XhoI和flag-tag标签)扩增得到2A-pEGX(770bp，酶切鉴定见图4A)，扩增体系=PrimeSTARHS (Premix) 25 μ I, Primer F3 lul, PrimerR4 lul,模板 50 ~200ng,灭菌蒸懼水补充到50 μ 10 最后利用引物 Fl (SEQ ID No: 11)和 R4(SEQ ID No: 14)，以 pBgA_2A 和 2A_pEGX 为模板，利用基因重叠延伸PCR，获得pBg2ApEG(核酸序列为SEQ ID No: 3，氨基酸序列为SEQID No: 4，2073bp，酶切鉴定见图 4B)，扩增体系:PrimeSTAR HS (Premix) 25 μ 1，Primer Fllul, PrimerR4 lul,模板50~200ng,灭菌蒸懼水补充到50 μ I。最后将pBg2ApEG克隆到 pCDNA3.1 (+)产生 pCD-pBg2ApEG (图 3)。
[0047]上述PCR 扩增条件为:98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 10 ~20S ；35 个循环；72°C 2min。
[0048]6、重组酶的动物细胞表达验证
[0049]将得到的重组酶蛋白pBgA3pEG和pBg2ApEG在猪肾pK15细胞表达检测，检测方法参考标准的细胞免疫荧光分析方法，对照control转染PCDNA3.1 (+)空载体。检测结果如图5，从图5可以看出，改造后的重组酶蛋白pBgA3pEG和pBg2ApEG都可以在猪肾pK15细胞中高效表达和翻译(绿色荧光部分)，其分布在整个细胞质中，而对照细胞，检测不到相关蛋白表达。
[0050]实施例2实施例1获得的重组β -葡聚糖酶蛋白对pH的稳定性试验
[0051 ] 将pCD-pBgA3pEG和pCD_pBg2ApEG转染猪肾pK15细胞，3天后收集细胞培养液作为初酶液，参见国家标准测定不同PH缓冲液中pBgA3pEG和pBg2ApEG β -葡聚糖酶活性。缓冲液为:0.1MKC1-HC1 (pH10-2.0),0.1M Na2HPO4 -柠檬酸盐(ρΗ2.6-7.6)及
0.1MTris-HCl (ρΗ8.0-9.0)。
[0052]将pBgA3pEG和pBg2ApEG及其单体酶在不同pH缓冲液中孵育2小时后，在最适pH条件下测定其剩余酶活。结果见图6，从图6可以看出，与单体酶相比，重组酶对pH的作用范围明显拓宽(pHl.0-7.0都能维持50%以上的酶活)，而单体酶pBgA的工作pH为1.0~
5.0，pH超过5.0，其酶活迅速降低，单体酶pEGX工作pH为4.0~7.5，pH低于4.5，酶活迅速降低。因此，经重组后，重组酶工作pH覆盖pHl.0~pH7.0,作用范围明显拓宽，在生产应用中，本发明重组酶可以适应整个胃肠道pHl.5~6.5，作用时间更持久，pH的稳定性得到了明显提高。
[0053]实施例3实施例1获得的两个重组β -葡聚糖酶蛋白的酶活力比较
[0054]将pCD-pBgA3pEG和pCD_pBg2ApEG转染猪肾pK15细胞，3天后收集细胞培养液作为初酶液，参见国家标准测定不同PH缓冲液中pBgA3pEG和pBg2ApEG β -葡聚糖酶活性。缓冲液为 0.1MNa2HPO4 -柠檬酸盐(ρΗ2.6-7.6)。
[0055]将pBgA3pEG和pBg2ApEG分别在缓冲液中孵育2小时后，在pH4.0和pH5.6的条件下测定其剩余酶活。结果见图7，从图7可以看出，重组酶pBgA3pEG比pBg2ApEG表现出更高的酶活。
[0056]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对 本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，其特征在于，所述重组葡聚糖酶的核苷酸序列为 SEQ ID No:1 或 SEQ ID No:3。
2.根据权利要求1所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，其特征在于，所述重组葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。
3.权利要求1或2所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶的重组方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)对微生物来源的葡聚糖酶基因Bgl7A和egl314的成熟肽区密码子进行优化，人工去除基因Bgl7A和egl314自身信号肽序列，将SEQ ID No:5所示的猪腮腺蛋白信号肽序列添加到密码子优化后的Bgl7A和egl314基因成熟肽N端进行基因改造，改造后的基因分别为:SEQ ID No:6 所示的 pBgA 和 SEQ ID No:7 所示的 pEGX ； (2)、将改造后的基因5，端和3，端分别添加EcoRI和XhoI限制性内切位点后，克隆到PUC57质粒中，再利用EcoRI和XhoI内切酶分别酶切，得到含有改造基因的内切酶片段，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体PCDNA3.1 (+)质粒中，分别获得载体pCDNA-pBgA和pCD-pEGX ； (3)、去除pEGX基因N端PSP信号肽序列，和pBgA基因C端的终子密码子，借助序列号为SEQ ID No:10的刚性肽A3连接，将pEGX基因连接到pBgA基因C端，并在pEGX基因C末端添加flag-tag标签,得到重组β -葡聚糖酶pBgA3pEG,其核苷酸序列为SEQ ID No:1,氨基酸序列为SEQ ID No:2 ； (4)、将步骤(3)获得的重组葡聚糖酶pBgA3pEG克隆到p⑶NA3.1 (+)载体中，获得pCD-pBgA3pEG ;以 pCD -pBgA3pEG 为模板，SEQ ID No: 11 和 SEQ ID No: 12 为引物进行第一次扩增得到pBgA-2A ;然后以步骤(2)中的载体pCD-pEGX为模板，SEQ ID No: 13和SEQ IDNo: 14为引物进行第二次扩增得到2A-pEGX ； (5)、以SEQID No:ll和SEQ ID No: 14作为引物，以步骤⑷获得的pBgA_2A和2A_pEGX为模板，进行基因重叠延伸PCR扩增,获得重组β -葡聚糖酶pBg2ApEG,其核苷酸序列为SEQID No:3，氨基酸序列为SEQ ID No:4。
4.根据权利要求3所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶的重组方法，其特征在于，步骤⑷和(5)中所述PCR扩增条件为:98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 10~20s; 35个循环；72°C 2min。
5.权利要求1或2所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶在制备细胞生物反应器或转基因动物中的应用。
【文档编号】C12N9/24GK103966188SQ201410161721
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】吴珍芳, 张献伟, 李紫聪, 刘德武, 贺晓燕 申请人:华南农业大学