检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明属于中药药材鉴别【技术领域】，具体涉及检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法。本发明要解决的技术问题是提供特异性的检测冬虫夏草中掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品的方法。本发明的技术方案是检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对。本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的试剂盒。本发明还提供了定量检测冬虫夏草超微粉及掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉的方法。本发明可用于冬虫夏草的质量检测，具有广阔的应用前景。
【专利说明】检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于商品化中药药材保健品鉴别领域，具体涉及检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Cordycepssinensis [Berk.] Sacc.)系子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordycep)真菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草主要分布在我国青海、西藏、云南、四川等地海拔3，000米以上的高寒草甸区，具有调节免疫系统，补肺益肾、止血化痰等功效，是我国珍稀的传统名贵中药材之一，市场价格昂贵。市场上出现了许多与冬虫夏草相似的菌粉产品，部分产品在冬虫夏草超微粉中掺入发酵粉或者直接使用发酵粉制成的产品。如何鉴定和区别并保证100%纯正冬虫夏草且无任何添加，让消费者放心食用，切实保证消费者利益，是目前亟待解决的难题。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供特异性的检测冬虫夏草中掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品比例的可靠方法。本发明的技术方案是检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0004]用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的PCR引物对:
[0005]上游引物(SEQID N0.1):5’GCAGTGGCATCTCTCAGTCA3’ ；
[0006]下游引物(SEQID N0.2):5’GCGTTCAAAGATTCGATGGT3’。
[0007]用于扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品特异DNA片段的PCR引物对:
[0008]上游引物(SEQID N0.3):5’ CCGGAGACCCCTAAACTCTG3’ ；
[0009]下游引物(SEQID N0.4):5’ CGATGCCAGAACCAAGA GAT3’。
[0010]本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加伪品的试剂盒，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0011]进一步的，所述试剂盒还包括含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC，按如下浓度独立包装:DC-12.0X106 拷贝 / μ L, DC-24.0X IO5 拷贝 / μ L, DC-38.0 X IO4 拷贝 /μ L、DC-41.6 X IO4 拷贝 / μ L、DC-53.2 X IO3 拷贝 /μ L0
[0012]进一步的，所述试剂盒还包括蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS，按如下浓度独立包装JS-12.0X106拷贝/ μ L, JS-24.0X 105拷贝/ μ L, JS-38.0X 104拷贝 / μ L、JS-41.6 X IO4 拷贝 / μ L、JS-53.2 X IO3 拷贝 /yL。
[0013]本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加伪品的方法，该方法包括以下步骤:
[0014]a、绘制标准曲线:以含冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到冬虫夏草标准品质粒标准曲线；以含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到蜡蚧轮枝菌发酵粉标准品质粒标准曲线；
[0015]b、提取样品总DNA;
[0016]C、荧光定量PCR:以样品总DNA为模板，以扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对分别进行荧光定量PCR，依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。
[0017]本发明经过充分的前期实验筛选和优化，得到有效的且特异性强的PCR引物对。本发明引物对能够有效地在荧光定量PCR仪上，分别特异地扩增冬虫夏草超微粉、标准品质粒DC和蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品、标准品质粒JS中的目标DNA片段；测定标准品在扩增过程中的荧光值，荧光定量PCR仪系统根据荧光值的变化规律生成标准曲线；依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。在痕量检测方面具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1、使用本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增冬虫夏草超微粉特异DNA片段和使用本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的电泳图。从左至右，第I泳道为Marker2000，第2、3泳道本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增冬虫夏草超微粉特异DNA片段，第4、5泳道为本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段。
[0019]图2、使用本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 的荧光定量 PCR 扩增曲线。
[0020]图3、使用本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 绘制的标准曲线。
[0021]图4、使用本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 绘制的溶解曲线。
[0022]图5、使用本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5的荧光定量PCR扩增曲线。
[0023]图6、使用本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5绘制的标准曲线。
[0024]图7、使用本发明引物对(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5绘制的溶解曲线。
[0025]图8、使用本发明引物对(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)扩增样品I (冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
[0026]图9、使用本发明引物对(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)扩增1_7号样品(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。[0027]图10、使用本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增样品I (冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
[0028]图11、使用本发明引物对(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)扩增1_7号样品(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
[0029]在图2~11中:Amplification Plot表不扩增曲线；Cycle表不循环数；StandardCurve表示标准曲线！Quantity表示总量；Melt Curve表示熔解曲线；Temperature表示温度。
【具体实施方式】[0030]为了定量测定冬虫夏草超微粉中掺入市售蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)的比例，本项目使用真菌ITS区域特异性引物进行实时荧光PCR定量分析。发明试剂盒中制备了用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的PCR引物对、用于扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的PCR引物对、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC、含有蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的标准品质粒JS。将测试样品和标准样品通过两种引物对的荧光PCR扩增后，由标准曲线求得样品中蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)的掺入比例。
[0031]以下结合附图通过【具体实施方式】对本发明进行具体说明。
[0032]实施例1检测用PCR弓丨物对的设计
[0033]根据GenBank上公开登录的真菌的18s-1TSl_5.8s-1TS2_28s核糖体基因序列信息进行引物的设计。
[0034]冬虫夏草的序列信息为GenBank:AB067721 (Cordyceps sinensisgenes for18S rRNA,ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and completesequences, isolate:GY0KU.TU, http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB067721, SEQ ID
N0.5)，下划线所示为引物区域:
[0035]
【权利要求】
1.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，其特征在于:包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
2.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的试剂盒，其特征在于:包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:还包括含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC，按如下浓度独立包装:DC-12.0XlO6拷贝/ μ L、DC-24.0XlO5拷贝/ μ L、DC-38.0X IO4 拷贝 / μ L、DC-41.6 X IO4 拷贝 / μ L、DC-53.2 X IO3 拷贝 /μ L0
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于:还包括蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS，按如下浓度独立包装JS-12.0X IO6拷贝/ μ L、JS-24.0X IO5拷贝/yL、JS-38.0X 104 拷贝 / μ L、JS-41.6X IO4 拷贝 / μ L、JS-53.2 X IO3 拷贝 /yL。
5.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: a、绘制标准曲线:以含冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到冬虫夏草标准品质粒标准曲线；以含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到蜡蚧轮枝菌发酵粉标准品质粒标准曲线； b、提取样品总DNA； C、荧光定量PCR:以样品总DNA为模板，以扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对分别进行荧光定量PCR，依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。
【文档编号】C12Q1/68GK103898236SQ201410168024
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】徐丽, 张雪峰, 王晓平 申请人:青海春天药用资源科技利用有限公司