Hif2a基因突变体及其检测与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医学分子生物学领域，旨在提供一种HIF2A基因突变体及其检测与应用。该分离的编码HIF2A突变体核酸的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。分离的HIF2A突变体多肽是由前述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本发明研究发现人HIF2A基因的SEQ?ID?NO：1所示序列中第2155位核苷酸G→A突变，导致SEQ?ID?NO：2所示序列中的第549位谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，使蛋白质的半衰期延长，下游基因的表达增高。基于此，本发明提供了HIF2A基因突变的检测方法。通过对该方法的应用，能够快速了解生物样品是否存在HIF2A基因突变。
【专利说明】HIF2A基因突变体及其检测与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学分子生物学领域，具体地，涉及分离的HIF2A突变体的核酸，分离的多肽，以及筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法和用于筛选易感肝癌和其他肝脏相关疾病的生物样品的试剂盒。
【背景技术】
[0002]肝癌的发生是环境和基因共同作用的结果，它是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，有资料表明，全球每年有超过50万新患者。全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国，仅我国每年就有约11万人死于肝癌。而肝癌起病隐匿，超过60%的肝癌患者在初次就诊时就已进入中晚期，失去根治治疗的机会，5 年总体生存率只有 7% 左右[Lin H, Yan J, Wang Z, et al.Loss of Immunity-supportedsenescence enhances susceptibility to hepatocellular carcinogenesis andprogression in TLR2_deficient mouse.Hepatology, 2013, 57 (I): 171-82.]。手术切除仍是治疗原发性肝癌的首选，但是众所周知，根治性切除后患者的5年复发率高、转移率高[于秀石，关媛媛，田菊霞.肝癌发生的相关分子机制研究.健康研究(基础理论研究)，2010，30(5):391-393.]。因此寻找实用有效的肝癌易感性筛查、早期诊断、治疗、预后判断的指标早已十分迫切。
[0003]随着肿瘤分子生物学理论和技术的飞速发展，对各种肝癌相关基因的认识不断深入，且原癌基因、抑癌基因、毒物代谢酶基因、DNA修复基因等的基因突变与肝癌易感性关系的研究也不断深入[郑霄雁，史习舜，胡志坚.肝癌相关基因突变与肝癌易感性的研究.中国肿瘤，2008，17 (5) =390-395.]，但是目前发现的肝癌相关基因的数量有限，且到目前为止，并没有十分理想的肝癌筛查、诊断、治疗、预后判断等的基因。因此，寻找可能的肝癌诱发基因，从而找出可靠的肝癌易感性筛查、早期诊断的指标以及肝癌预后判断的新依据，仍然是当今肝癌研究的热点。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种HIF2A基因突变体及其检测与应用。
[0005]为解决技术问题，本发明的解决方案是:
[0006]提供一种分离的编码HIF2A突变体核酸，该突变体核酸的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本发明进一步提供了一种分离的HIF2A突变体多肽，该突变体多肽是由权利要求1所述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本发明进一步提供了一种检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的方法，包括以下步骤:
[0009](I)确定在生物样品中是否具备HIF2A基因编码的SEQ ID NO:2所示的第549位氨基酸，或者SEQ ID NO:1所示的第2155位核苷酸；
[0010]该步骤具体包括:利用HIF2A基因的第12外显子特异性的引物，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；
[0011]所述的生物样品是指分离自人体的血液、各种器官的组织、皮肤、毛发或口腔黏膜，能够用于分离获得权利要求1中所述突变体核酸，或者是通过反转录反应获得CDNA样本以构成所述核酸样本；
[0012]所述HIF2A基因的第12外显子特异性的引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
[0013](2)检测在所述核苷酸位置是否存在G — A突变，以及所述氨基酸序列是否存在E — K突变；
[0014]该步骤具体包括:通过比对测序核苷酸图谱,第2155位核苷酸由G变为A，⑶S编码序列上看是第1645位核苷酸发生突变，即发生c.G1645A突变，密码子GAG变为AAG，翻译后氨基酸序列第549个谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，即发生p.E549K突变。
[0015]本发明进一步提供了所述编码HIF2A突变体核酸在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。
[0016]本发明进一步提供了所述编码HIF2A突变体多肽在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0018]本发明研究发现人HIF2A基因的SEQ ID NO:1所示序列中第2155位核苷酸G — A突变，导致SEQ ID NO:2所示序列中的第549位谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，使蛋白质的半衰期延长，下游基因的表达增高。基于此，本发明提供了 HIF2A基因突变的检测方法。通过对该方法的应用，能够快速了解生物样品是否存在HIF2A基因突变。作为对本发明的衍伸应用，可以作为发现肝癌及肝脏相关疾病的潜在易感性患者的新的判断依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为含突变位点的患者的正向引物测序图，突变型(G/A)；
[0020]图2为对照组不含突变位点的正常健康人的正向引物测序图，野生型(G/G)；
[0021]图3为含突变位点的患者的反向引物测序图，突变型(C/T)；
[0022]图4为对照组不含突变位点的正常健康人的反向引物测序图，野生型(C/C)；
[0023]图5为根据本发明实施例对多个物种HIF2A蛋白质的序列进行比对的结果，其中531位为脯氨酸羟基化位点。
[0024]图6为病人的红细胞、血细胞比容和血红蛋白变化趋势，其入院前的血常规中，红细胞、血细胞比容和血红蛋白都高于正常，手术后其红细胞、血细胞比容和血红蛋白又开始呈现逐渐增高的趋势。
【具体实施方式】
[0025]以下概括描述本发明要求保护的技术方案:
[0026]1.本发明提供了从各型肝病中分离HIF2A新突变致病基因，具有突变的序列(如SEQ ID NO:1所示)，第2155位碱基发生G — A的突变。[0027]本发明通过Sanger测序的方法确定了肝癌及其他肝脏相关疾病的新的致病基因突变(HIF2Ac.G1645A, p.E549K)。
[0028]HIF2A基因突变体
[0029]根据本发明的实施例，该核酸具有突变的序列(如SEQ ID NO:1所示)。在本文中所使用的表达方式“编码HIF2A突变体的核酸”，是指与编码HIF2A突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与HIF2A突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码HIF2A突变体的核酸为DNA。
[0030]根据本发明的实施例，发明人确定了 HIF2A基因的新突变体，这些新突变体与肝癌及其他肝脏相关疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易感肝癌及其他肝脏相关疾病的目的。
[0031]该编码HIF2A突变体的核酸，是本申请的发明人通过Sanger法测序方法确定的肝癌及其他肝脏相关疾病的致病基因上的新突变。本次发现的突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。
[0032]突变型HIF2A基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，其编码的HIF2A蛋白(编码区)，该蛋白质含有870个氨基酸，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0033]发明人发现的新突变体如SEQ ID NO:2所示，具有ρ.Ε549Κ突变，即本发明的HIF2A基因突变体的cDNA中第2155位的G突变为A，由此，其所编码的产物HIF2A蛋白(如SEQID NO:2所示)，具有p.E549K突变，即549位的E (谷氨酸)突变为K(赖氨酸)。
[0034]本发明还提供了从各型肝病中分离的肝癌及其他肝脏相关疾病的HIF2A新突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具有p.Ε549Κ突变。该新突变体与肝癌及其他肝脏相关疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易感肝癌及其他肝脏相关疾病的目的。
[0035]本发明根据获得的突变基因获得了分离的突变体多肽，该多肽具有P.Ε549Κ突变，其序列如SEQ IDNO:2所示。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码HIF2A突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以达到有效地预测生物体是否易感肝癌及其他肝脏相关疾病的目的。
[0036]3.本发明的实施例还提供了筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法，包括以下步骤:从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有c.G1645A突变是所述生物样品易感肝癌及其他肝脏相关疾病的指示。
[0037]通过根据本发明实施例的筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法，可以达到有效地筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的目的。
[0038]筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法
[0039]本发明提出了一种筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法可以包括以下步骤:
[0040]首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品HIF2A是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体的血液、各种器官的组织、皮肤、毛发或口腔黏膜中的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中HIF2A是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含HIF2A编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的效率。
[0041]另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括:从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA ；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的效率。
[0042]接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术,针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。 由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括:首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自HiSeq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集HIF2A外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括:利用HIF2A外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集HIF2A外显子(尤其是第12号外显子)，从而能够进一步提高筛选易感肝癌及其他肝脏相关病的生物样品的效率。
[0043]根据本发明的实施例，HIF2A外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些HIF2A外显子特异性引物具有SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列:
[0044]AGGAGCTGAGTTGGAATAGTG(SEQ ID NO:3)
[0045]CCAGCTATCTTACTAGTGGGTG(SEQ ID NO:4)
[0046]关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample PreparationGuide(Part#1005361 ；Feb2010)或 Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063 ；Feb2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0047]需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应HIF2A的编码序列即可。
[0048]最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列如SEQID NO:I的序列所不。如果在所得到的核酸序列中具有c.G1645A突变,则指不生物样品易感肝癌及其他肝脏相关疾病。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。
[0049]需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。
[0050]4.作为对本发明的衍伸应用，本发明的实施例还可制备筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的试剂盒。包括:适于检测HIF2A基因突变体的试剂，所述HIF2A基因突变体如SEQ ID NO:1所示，具有c.G1645A突变。
[0051]根据本发明的实施例，该用于筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的试剂盒包括:适于检测HIF2A基因突变体的试剂如SEQ ID NO:1所示，该HIF2A基因突变体具有c.G1645A突变。利用根 据本发明的实施例的试剂盒，能够达到有效地筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的目的。在本文中，所使用的术语“适于检测HIF2A基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测HIF2A编码基因的试剂，也可以是检测HIF2A突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针，由此，可以达到高效地筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的目的。
[0052]需要说明的是，在本文前面筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感肝癌及其他肝脏相关疾病的生物样品的试剂盒，在此不再赘述。
[0053]下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0054]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
[0055]本发明人通过广泛深入的研究发现了人HIF2A基因12外显子上的杂合突变(c.G1645A)。
[0056]某男性患者患乙型肝炎数年，入院前的血常规检查发现，其红细胞、血细胞比容和血红蛋白都高于正常，其43岁时的一次体检中被发现患有肝脏血管瘤，随后的B超检查，CT以及MRI (核磁共振)检查发现他的右肝占位性病变，手术切除后病理诊断为肝癌，且手术后其红细胞、血细胞比容和血红蛋白又开始呈现逐渐增高的趋势。已有的研究表明，HIF2A的突变能够引起红细胞增多症的发生，且HIF2A能结合到DNA上，影响一些基因的表达，除了促红细生成素(EPO)之外，还包括VEGF，EDN1，GLUT等，一系列的这些基因都与细胞的生长、增殖、凋亡，甚至与肿瘤的侵润相关，同时研究已发现HIF2A突变能诱发副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、生长抑素瘤的发生，且在具有肝特异性HIF2A突变的小鼠模型中发现，突变引起了小鼠的红细胞增多症和肝血管瘤。但到目前为止，从未有临床报道发现人HIF2A的突变与肝癌的相关性。
[0057]发明人发现的HIF2A基因12外显子上的的杂合突变(c.G1645A)，使HIF2A的549位氨基酸E变为K，蛋白质的半衰期延长，且下游基因的表达升高，最终导致病人的红细胞增多，诱发了病人的肝脏血管瘤，最终诱发肝癌的发生，且因为病人的血管生长因子(VEGF)表达比未突变病人升高，因此可以通过检测其突变来预测其预后及肝癌的易转移与否的情况，当然，也可以对在血常规检查中经常出现红细胞、血细胞比容或血红蛋白升高的乙肝患者进行HIF2A12外显子上的的杂合突变(C.G1645A)的筛查，从而确定检测对象的肝血管瘤，肝癌及其他肝脏相关疾病的易感性及对患者的预后进行判断。也可能通过某种特定的技术干扰突变基因表达从而对患者进行治疗。
[0058]人HIF2A基因的开放阅读框为第(511)-(3123)位，人HIF2A的基因组序列从GenBank中获得。
[0059]用本发明的方法或检测的试剂盒所用的引物和探针，根据HIF2A基因的cDNA序列或基因组序列进行设计，并用常规的合成技术进行合成即可。
[0060]I实施例1病人的筛查
[0061]对临床上伴有红细胞、血细胞比容或血红蛋白增高的乙型肝炎患者进行筛查，对其组织、血液、咽拭子、或者毛囊等的生物样品进行采集，同时采集正常健康人对照组的同样的生物样本。所有样本都来源于浙江大学医学院附属第一医院，所有成员均经过知情同
O
[0062]2实施例2确定人HIF2A基因突变
[0063]I基因组DNA的抽提和测序
[0064]利用DNeasy Blood&Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取患者和正常健康人对照组的血液或其他生物样品中的基因组DNA，利用针对HIF2A序列12外显子的引物，以及试剂盒 TaKaRa Ex Taq?(Mg2+free Buffer) (TaKaRa, Japan)做普通 PCR 扩增。所得的 DNA进行纯度和浓度检测，每个标本基因组DNA的0D260/0D280均位于1.8-2.3之间，浓度不少于 20ng/μ L0
[0065]引物序列为:
[0066]正义引物:(AGGAGCTGAGTTGGAATAGTG)SEQ ID NO:3
[0067]反义引物:(CCAG CTATCTTACTAGTGGGTG)SEQ ID NO:4
[0068]扩增体系:(总体积50 μ L)
[0069]
【权利要求】
1.一种分离的编码HIF2A突变体核酸，其特征在于，该突变体核酸的基因序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种分离的HIF2A突变体多肽，其特征在于，该突变体多肽是由权利要求1所述突变体核酸编码的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。
3.—种检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)确定在生物样品中是否具备HIF2A基因编码的SEQID NO:2所示的第549位氨基酸，或者SEQ ID NO:1所示的第2155位核苷酸； 该步骤具体包括:利用HIF2A基因的第12外显子特异性的引物，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序； 所述的生物样品是指分离自人体的血液、各种器官的组织、皮肤、毛发或口腔黏膜，能够用于分离获得权利要求1中所述突变体核酸，或者是通过反转录反应获得cDNA样本以构成所述核酸样本； 所述HIF2A基因的第12外显子特异性的引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； (2)检测在所述核苷酸位置是否存在G— A突变，以及所述氨基酸序列是否存在E — K突变； 该步骤具体包括:通过比对测序核苷酸图谱，第2155位核苷酸由G变为A，⑶S编码序列上看是第1645位核苷 酸发生突变，即发生c.G1645A突变，密码子GAG变为AAG，翻译后氨基酸序列第549个谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)，即发生p.E549K突变。
4.权利要求1所述编码HIF2A突变体核酸在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。
5.权利要求1所述编码HIF2A突变体多肽在制备用于检测生物样品是否存在HIF2A基因突变的试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103993016SQ201410172171
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】李兰娟, 曹红翠, 苏晓茹, 俞炯 申请人:浙江大学