一种核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS及其重组载体与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS及其重组载体与应用。所述核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS是通过将野生型大鼠FoxO3a肽链中第32位苏氨酸、252位丝氨酸、314位丝氨酸同时替换为丙氨酸。其中，所述突变体rFoxO3a-MTSS的氨基酸序列SEQ?IDNO.1所示；编码该突变体的核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示。本发明公开的突变体rFoxO3a-MTSS相对野生型rFoxO3a而言，具有能够避免被其上游调控因子Akt磷酸化的特点，能够在体内保持持续活化状态，对研究FoxO3a基因的功能及FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗均具有重要的科学意义与潜在应用价值。
【专利说明】—种核转录因子突变体rFox03a-MTSS及其重组载体与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种转录因子突变体，特别涉及一种核转录因子突变体rFOX03a-MTSS及其重组载体与应用。
【背景技术】
[0002]核转录因子Fox03a 可通过调节 Bim、Fas Iigand(FasL)、TNFR2、p27、p53、抗氧化物酶等多种下游靶基因的转录而发挥促细胞凋亡、细胞周期阻滞及抗氧化等不同的生物学功能。既往研究表明，Fox03a广泛分布于哺乳动物的多种组织和细胞中，并参与糖代谢、骨骼肌的分化发育、血管发生、抑制细胞增殖、抑制心肌肥厚等生理和病理过程。因此，研究不同病理及生理条件下Fox03a转录因子的功能越来越受到人们的广泛关注。Akt是哺乳细胞中广谱存在的经典信号分子，可通过促进Fox03a的磷酸化而使其失活，从而给体内研究Fox03a基因的功能造成了巨大困难。
[0003]目前，国内外的研究重点放在了人类组织及细胞中Fox03a的功能研究。在人体组织及细胞中，Fox03a在体内可被其上游调控因子Akt磷酸化其Thr-32、Ser_253及Ser-315等位点而导致转录因子Fox03a失活。然而，大鼠已经成为研究人类重大疾病的经典模式动物，尤其是在一些需要进行外科手术的疾病模型中，大鼠比小鼠更具有优势，越来越受到人们的关注。然而，人源及大鼠来源的Fox03a基因序列存在一定差异，而且其在体内被Akt激活的位点不同。因此，本发明利用基因操作技术，构建大鼠Fox03a基因的突变体及其重组质粒，使其能够摆脱Akt磷酸化的影响而在体内持续活化，为利用大鼠模型研究Fox03a基因的功能及相关疾病的治疗提供了强有力的手段，可广泛应用于Fox03a基因相关的大鼠细胞及动物模型研究，具有重要的科学意义与应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种核转录因子突变体rFox03a-MTSS。
[0005]本发明的另一目的在于提供含有编码上述核转录因子突变体rFoX03a-MTSS核苷酸序列的重组载体。
[0006]本发明的再一目的在于提供上述重组载体的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008] —种核转录因子突变体rFox03a_MTSS,其氨基酸序列如下所示:
MAEAPASPVPLSPLEVELDPEFEPQSRPRSC § WPLQRPELQASPAKPSGETAADSMIPEE60DDDEDDEDSGGRG
SSAMVIGGGVSSALGSGLLLEDSARLLSPGGQDLGTGPASSAGALSG I20GTQTQLQPQQPLPPPQPGAAGGSGQPRKCSSRRNAWGNLSYADLITRAIESSPDKRLTLS 180QIYEWMVRCVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSR
FMRVQNEGTGKSSffffIINPDGG 240KSGKAPRRRAV MDNSNKYTKSRGRAAKKKAALQAAPESADDSPSQLSKWPGSPTSRSSD 300ELDAWTDFRSRTN § NASTVSGRLSPILASTELDDVQDDDGPLSPMLYSSSASLSPSVSKP
360CTVELPRLTDMAGTMNLNDGLAENLMDDLLDNIALPPSQASPPGGLMQRSSSFPYTAKSS 420GLGSPTSSFNSTVFGPASLNSLRQSPMQTIQENRPATFSSVSHYGNQTLQDLLTSDSLSH 480SDVMMTQSDPLMSQASTAVSAQNARRNVMLRNDPMMSFAAQPTQGSLVNQNLLHHQHQTQ 540GALGGSRALSNSVSNMGLSDSSSLGSAKHQQQSPVSQSMQTLSDSLSGSSLYSASANLPV 600MGHDKFPSDLDLDMFNGSLECDMESIIRSELMDADGLDFNFDSLISTQNVVGLNVGNFTG 660AKQASSQSWVPG*672
[0009] 编码上述核转录因子突变体rFox03a-MTSS的核苷酸序列如下所示:1ATGGCAGAGGCACCAGCCTC CCCGGTCCCG CTCTCTCCGC TCGAAGTGGA GCTGGACCCA61 GAGTTCGAGC CACAGAGTCG
GCCACGCTCC TGT @ TGGC CCCTGCAGAG GCCGGAGCTG121 CAGGCGAGCC CGGCCAAGCC
CTCGGGGGAGACGGCGGCAG ACTCCATGATCCCCGAGGAG18I GACGACGATG AAGACGACGA
GGACAGCGGCGGCCGAGGCA GCTCGGCCATGGTGATCGGT241 GGCGGCGTGA GCAGTGCGCT
GGGCTCCGGGCTGCTCCTCG AAGATTCGGCCAGGCTGCTG301 TCTCCCGGAG GGCAGGACCT
CGGGACGGGGCCAGCGTCCT CCGCAGGCGCGCTGAGTGGG36I GGCACGCAGA CGCAGCTGCA
GCCTCAGCAGCCACTGCCAC CGCCGCAGCCGGGGGCGGCT421 GGGGGCTCTG GGCAACCGAG
GAA ATGCTCCTCGCGGCGGA ATGCCTGGGGGAACCTGTCC481 TACGCTGACC TGATCACCCG
CGCCATCGAGAGCTCCCCGG ACAAACGGCTCACTTTGTCC541 CAGATCTACG AGTGGATGGT
GCGCTGTGTGCCCTACTTCA AGGATAAGGGCGACAGCAAC601 AGCTCTGCGG GCTGGAAGAA
CTCCATCCGCCACAACCTGT CACTGCACAGCCGTTTCATG661 CGGGTTCAGA ACGAAGGGAC
TGGCAAGAGCTCTTGGTGGA TCATCAACCCCGATGGGGGA72I AAGAGTGGGA AGGCTCCCCG
GCGGCGGGCC GTC 回 TGG ACAACAGCAA CAAGTACACC78I AAGAGCCGAG GCCGGGCAGC
CAAGAAGAAG GCGGCCCTGC AGGCTGCCCC AGAGTCGGCA841 GACGACAGCC CTTCCCAACTCTCCAAGTGG CCGGGCAGCC CCACATCCCG CAGCAGCGAC90I GAGCTGGACG CCTGGACCGA
CTTCCGCTCG CGCACCAAT 舊—(? AACGCCAG CACCGTGAGC961 GGCCGCCTGT CACCCATCTT
GGCGAGCACGGAGCTGGATG ACGTCCAGGACGATGACGGG102ICCCCTCTCCCCCATGCTCTA
CAGCAGCTCTGCCAGCCTGT CGCCTTCCGTAAGCAAGCCG108ITGTACCGTGGAGCTGCCGCG
GCTGACTGACATGGCGGGCA CCATGAATCTGAACGATGGG1141CTGGCCGAGAACCTCATGGA
TGACCTGCTAGATAACATCG CGCTCCCGCCCTCCCAGGCG1201TCGCCTCCTGGCGGGCTTAT
GCAGCGGAGCTCCAGCTTCC CGTACACCGCCAAGAGCTCC1261GGCCTGGGCTCCCCAACCAG
CTCCTTTAACAGTACCGTGT TCGGACCTGCGTCACTCAAC1321TCCCTGCGCC AGTCGCCCAT
GCAGACCATCCAGGAGAACA GACCAGCCACCTTTTCTTCC1381GTGTCGCACTACGGCAACCA
GACACTCCAAGACCTGCTCA CTTCGGACTCGCTCAGCCAC1441AGCGATGTCATGATGACCCA
GTCAGACCCCTTGATGTCTC AGGCTAGCACCGCTGTGTCC1501GCCCAGAACGCCCGCCGGAA
CGTGATGCTTCGCAACGACC CAATGATGTCCTTTGCCGCC1561CAGCCTACCCAGGGGAGTTT
GGTCAATCAGAACTTGCTCC ACCACCAGCACCAAACCCAG1621GGCGCTCTTG GTGGCAGCCG
TGCCTTGTCAAATTCTGTCA GCAACATGGGCTTGAGTGAC168ITCCAGCAGCC TCGGCTCAGC
CAAACACCAGCAGCAGTCTC CCGTCAGCCAGTCTATGCAA1741ACCCTCTCGGACTCTCTCTC
AGGCTCCTCACTGTATTCAG CCAGTGCAAACCTTCCCGTC1801ATGGGTCACGACAAGTTCCCCAGTGACTTG GACCTGGACA TGTTCAATGG GAGCTTGGAG186I TGTGACATGG AGTCCATCATCCGTAGCGAA CTCATGGATG CCGATGGGTT GGATTTTAAC1921 TTTGACTCCC TCATCTCCACACAGAACGTT GTTGGTTTGA ACGTGGGGAA CTTCACTGGT1981 GCTAAGCAGG CCTCATCTCAAAGCTGGGTG CCAGGCTGA
[0010]一种重组载体，含有编码上述核转录因子突变体rFOX03a-MTSS的核苷酸序列；
[0011]所述的重组载体优选为将编码上述核转录因子突变体rFox03a-MTSS的核苷酸序列克隆到真核细胞表达载体上得到；
[0012]所述的真核细胞表达载体优选为pEGFP-Nl ；
[0013]所述的重组载体优选为pEGFP-rFox03a_MTSS，其通过如下具体步骤制备得到:
[0014](I)根据NCBI数据库中大鼠Fox03a(rFox03a)基因(ΝΜ_001106395)的序列信息，设计PCR引物，扩增野生型大鼠Fox03a基因的CDS编码区的全长序列，并将其克隆到PEASY-T3克隆载体中，得到重组载体pEASY-rFox03a-CDS ；
[0015](2)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体pEASY-rFox03a-CDS中编码Fox03a肽链中第32位苏氨酸的碱基ACG突变为GCG，从而将野生型大鼠Fox03a肽链中第32位的苏氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体pEASY-rFox03a-MT32 ；
[0016](3)利用KOD-P lus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体PEASY-rFox03a-MT32中编码Fox03a肽链中第252位丝氨酸的碱基TCC突变为GCC，从而将突变体pEASY-rFox03a-MT32所编码肽链中第252位的丝氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体 pEASY-rFox03a-MT32S252 ；
[0017](4)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体pEASY-rFox03a-MT32S252中编码Fox03a肽链中第314位丝氨酸的碱基TCC突变为GCC，从而将突变体pEASY-rFox03a-MT32S252所编码肽链中第314位的丝氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体 pEASY-rFox03a-MT32S252S314 ；
[0018](5)设计5’端分别包含Xho I及Sac II酶切位点的引物序列对，以突变体重组载体pEASY-rFox03a-MT32S252S314为模板扩增突变后的Fox03a基因编码序列(不包含终止密码子)，将其克隆到pEGFP-Nl表达载体上，得到突变体重组载体pEGFP-rFox03a-MTSS。
[0019]步骤(1)中所述的PCR引物为⑶S-F与⑶S-R，其序列如下所示:
[0020]CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
[0021]CDS-R:5，-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3，；
[0022]步骤(2)中所述的突变引物为MT32-F及MT32-R，其序列如下所示:
[0023]MT32-F:5’ -TGTGCGTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3’ ；
[0024]MT32-R:5， -GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3，；
[0025]步骤(3)中所述的突变引物为MS252-F及M S252-R，其序列如下所示:
[0026]MS252-F:5， -GTCGCCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3，；
[0027]MS252-R:5， -GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTT T_3，；
[0028]步骤⑷中所述的突变引物为MS314-F及MS314-R，其序列如下所示:
[0029]MS314-F:5， -AATGCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3，；
[0030]MS314-R: 5 ’ -GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3，；[0031]步骤(5)中所述的包含Xho I及Sac II酶切位点的引物为⑶SM-F与⑶SM-R，其序列如下所示:
[0032]CDSM-F:5，-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3，；
[0033]CDSM-R:5，-TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3’ ；
[0034]所述的重组载体可应用于研究Fox03a基因的功能以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗。
[0035]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0036]与野生型Fox03a基因编码的蛋白相比，本发明中的核转录因子突变体rFox03a-MTSS在其编码肽链的第32、252及314等三个位点的氨基酸同时存在突变，均突变为丙氨酸。所述突变体编码的融合蛋白可在细胞内有效表达，能够避免细胞内Akt蛋白的磷酸化而保持体内持续激活状态，不仅可实现细胞内Fox03a的稳定高表达，同时为利用大鼠模型研究Fox03a基因的功能及相关疾病的治疗提供了强有力的手段，可广泛应用于Fox03a基因相关的大鼠细胞及动物模型研究，具有重要的科学意义与应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是本发明所述重组载体pEGFP-rFox03a_MTSS转染293T细胞的荧光显微镜图，其中，对照为空白对照组，pEGFP-Nl为空载体pEGFP-Nl转染组，pEGFP-rFox03a_WT为重组载体pEGFP-rFox03a-WT转染组， [0038]PEGFP-rFox03a-MTSS为重组载体pEGFP-rFox03a_MTSS转染组；荧光为荧光显微镜观察图片；白光为白光显微镜观察图片；合并为合并图片；转染时间为24小时；放大倍数为200倍。
[0039]图2是利用Western blotting技术检测重组载体pEGFP-rFox03a_MTSS转染293T细胞后rFox03a蛋白及其上游调控因子Akt的表达变化，其中，对照为空白对照组，pEGFP-Nl 为空载体 pEGFP-Nl 转染组，pEGFP-rFox03a_WT 为重组载体 pEGFP-rFox03a_WT 转染组，pEGFP-rFox03a-MTSS为重组载体pEGFP-rFox03a_MTSS转染组；转染时间均为72小时。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0041]实施例lrFox03a基因的CDS片段扩增及克隆
[0042](I)引物设计
[0043]通过GeneBank 数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)查询大鼠Fox03a基因的mRNA信息，用Primer Primer5.0软件设计引物CDS-F与CDS-R，用于扩增大鼠Fox03a基因⑶S编码区。其中，所述引物序列为:
[0044]CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
[0045]CDS-R:5，-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3，；
[0046](2)大鼠Fox03a基因编码区CDS的PCR扩增
[0047]用TRIzol试剂盒(Invitrogen)提取SD大鼠(购买于广东省医学实验动物中心)心脏组织总RNA，并用反转录试剂盒(TOYOBO)合成cDNA，并稀释至200ng/ μ L。以cDNA为模板，用KOD-Plus-Neo高保真酶(Τ0Υ0Β0)进行PCR扩增，具体反应体系如下所示:
[0048]表1大鼠Fox03a基因编码区⑶S的PCR扩增反应体系
[0049]
【权利要求】
1.一种核转录因子突变体rFox03a-MTSS，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所/Jn ο
2.编码权利要求1所述核转录因子突变体rFox03a-MTSS的核苷酸序列，其特征在于:所述的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.—种重组载体，其特征在于:含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于:所述的重组载体为将权利要求2所述的核苷酸序列克隆到真核细胞表达载体上得到。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述的真核细胞表达载体为pEGFP-Nl。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述的重组载体为pEGFP-rFox03a-MTSS,其通过如下具体步骤制备得到: (1)根据NCBI数据库中大鼠Fox03a基因的序列信息，设计PCR引物，扩增野生型大鼠Fox03a基因的⑶S编码区的全长序列，并将其克隆到PEASY-T3克隆载体中，得到重组载体pEASY-rFox03a-CDS ； (2)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体pEASY-rFox03a-CDS中编码Fox03a肽链中第32位苏氨酸的碱基ACG突变为GCG，从而将野生型大鼠Fox03a肽链中第32位的苏氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体pEASY-rFox03a-MT32 ； (3)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体PEASY-rFox03a-MT32中编码Fox03a肽链中第252位丝氨酸的碱基TCC突变为GCC，从而将突变体pEASY-rFox03a-MT32所编码肽链中第252位的丝氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体 pEASY-rFox03a-MT32S252 ； (4)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体pEASY-rFox03a-MT32S252中编码Fox03a肽链中第314位丝氨酸的碱基TCC突变为GCC，从而将突变体pEASY-rFox03a-MT32S252所编码肽链中第314位的丝氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体 pEASY-rFox03a-MT32S252S314 ； (5)设计5’端分别包含XhoI及Sac II酶切位点的引物序列对，以突变体重组载体pEASY-rFox03a-MT32S252S314为模板扩增突变后的Fox03a基因编码序列，将其克隆到pEGFP-Nl表达载体上，得到突变体重组载体pEGFP-rFox03a-MTSS。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于: 步骤⑴中所述的PCR引物为⑶S-F与⑶S-R，其序列如下所示:
CDS-F:5，-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3，；
CDS-R:5’ -CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3’。
8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于: 步骤(2)中所述的突变引物为MT32-F及MT32-R，其序列如下所示:
MT32-F:5’ -TGTGCGTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3’ ；
MT32-R:5’ -GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3’ ； 步骤(3)中所述的突变引物为MS252-F及M S252-R，其序列如下所示:
MS252-F:5，-GTCGCCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3，；M S252-R:5， -GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTT T_3，； 步骤(4)中所述的突变引物为MS314-F及MS314-R，其序列如下所示:
MS314-F:5，-AATGCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3，；
M S314-R:5’ -GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3’ ；
9.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于: 步骤(5)中所述的包含Xho I及Sac II酶切位点的引物为⑶SM-F与⑶SM-R，其序列如下所示:
CDSM-F:5，-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3，；
CDSM-R:5’ -TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3，。
10.权利要求3~9任一项所述的重组载体在Fox03a基因的功能研究以及Fox03a基因有关疾病的靶向治疗研 究中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK103965345SQ201410178820
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】齐绪峰, 李昀键, 陈卓莹, 夏景波, 蔡冬青, 龙颖妍, 赵天琪, 吴彩红, 王健欢 申请人:暨南大学