一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。编码上述偏甘油酯脂肪酶的基因序列如SEQID?NO:1所示。本发明获得中性脂肪酶，在pH7.0具有最适酶活性，其对橄榄油的水解反应中，最适温度为40℃；对大豆卵磷脂为底物的水解反应中，最适反应温度为30℃。MAJ1对茶油的水解反应表明其是一个1,3位选择性的偏甘油酯脂肪酶。同时该脂肪酶在20℃～30℃处理3小时仍然具有大于95％的酶相对剩余活性，可以应用于去除油脂中偏甘油酯。
【专利说明】一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，也称为三酰基甘油酰基水解酶，能够催化甘油三酯水解，生成的产物包括甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油。偏甘油酯脂肪酶是指对酰基甘油碳链数量具有催化选择性的一类脂肪酶，它们对甘油三酯并没有催化水解活力，仅对甘油二酯和/或甘油单酯具有活力。偏甘油酯脂肪酶主要有两类:甘油单酯-甘油二酯脂肪酶和甘油单酯脂肪酶。偏甘油酯脂肪酶在饲料添加剂、食品与营养，农业、日用化学工业都展现出诱人的应用前景。在油脂加工领域，偏甘油酯脂肪酶可用于制备高纯度的甘油酯产品。因此，新型偏甘油酯脂肪酶的开发为高效制备甘油二酯和开发高纯度的甘油二酯生产工艺提供现实意义。
[0003]目前已知微生物来源的偏甘油酯脂肪酶非常有限。另外，国内开发的脂肪酶的酶学性质并不能适应新的使用需求。目前使用的脂肪酶大多都是中温酶(其最适温度基本都在50°C左右)，而在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域中，却需要低温脂肪酶的参与来进行。因此，开发低温酶获得新型有工业价值的偏甘油酯脂肪酶有潜在的需要。利用生活在高盐度、高压、低营养和低温等的所谓生命极限环境下的微生物，筛选新型低温酶成为寻找符合工业化要求的脂肪酶的主要途径之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种对偏甘油酯水解活性高的海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，可以应用于选择性去除油脂产品中的偏甘油酯，以使其满足工业上的需要。
[0005]本发明的第一个方面公开了一种来自海洋微生物的新型偏甘油酯脂肪酶。
[0006]本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的优化的核酸分子，获得在毕赤酵母高表达的偏甘油酯脂肪酶。
[0007]本发明的第三个方面，提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。
[0008]本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。
[0009]本发明的第五个方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化偏甘油酯水解反应。
[0010]本发明的第六个方面，提供了一种生产上述脂肪酶的方法。
[0011]本发明的技术方案具体如下:
[0012]一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，该酶是对两面神菌(Janibactersp.HTCC2649)偏甘油酯脂肪酶基因序列进行优化得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所
/Jn ο
[0013]一种偏甘油酯脂肪酶基因，序列如SEQ ID NO:1所示。[0014]—种包含上述基因的表达载体。
[0015]一种细胞，包含上述表达载体，或其基因组中整合有上述脂肪酶基因。
[0016]一种生产上述脂肪酶的方法，包括:培养上述细胞，从培养物中分离出表达产物。
[0017]一种偏甘油酯脂肪酶重组菌株的制备方法，包括如下步骤:
[0018](I)制备偏甘油酯脂肪酶表达质粒:
[0019]a.人工合成权利要求2的基因序列；
[0020]b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 a感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒； [0021](2)利用表达质粒制备重组菌株:
[0022]a.将步骤⑴的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
[0023]b.将转化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30°C培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
[0024]步骤⑴所述PCR的引物序列如下:
[0025]MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3’
[0026]MAJl Rev 5， -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3，。
[0027]步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)。
[0028]上述脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯，或用于植物油精炼过程中的酶法脱胶。
[0029]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0030](I)本发明获得中性脂肪酶，在pH7.0具有最适酶活性，其对橄榄油的水解反应中，最适温度为40°C;对大豆卵磷脂为底物的水解反应中，最适反应温度为30°C。同时该脂肪酶在20°C~30°C处理3小时仍然具有大于95%的酶相对剩余活性。因此，可以通过温度来调节其脂肪酶和磷脂酶活性。
[0031](2)本发明所得毕赤酵母表达菌株具有良好的偏甘油酯水解活性，也是首个海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，同时该酶的脂肪酶和磷脂酶活性相当，因此，可应用于植物油精炼过程中的酶法脱胶，也可应用于去除油脂中的偏甘油酯。同时，作为一种低温酶，可广泛运用于食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等需要低温脂肪酶参与的领域中。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为来自两面神菌HTCC2649的编码脂肪酶的核酸序列MAJl及其优化后的编码脂肪酶的核酸序列MAJl-optimum(SEQ ID NO:1)。
[0033]图2为两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶MAJl在质粒pGAPZ a A上的重组子结构图。
[0034]图3为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的最适反应温度，以温度对相对酶活力(％)作图。
[0035]图4为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的最适反应pH,以pH对相对酶活力(％ )作图。[0036]图5为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的热稳定性，以温度对残余酶活力(％)作图。
[0037]图6为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的pH稳定性，以pH对残余酶活力(％ )作图。
[0038]图7为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的温度对脂肪酶酶活的影响。
[0039]图8为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的PH对脂肪酶酶活的影响。
[0040]图9为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的温度对磷脂酶酶活的影响。
[0041]图10为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶的PH对磷脂酶酶活的影响。
[0042]图11为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表达两面神菌HTCC2649来源的脂肪酶纯化后样品的SDS-PAGE电泳图。泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是纯化后的MAJl。
[0043]图12为脂肪酶的脂肪酸底物链长选择性图。
[0044]图13为 脂肪酶的催化植物油水解反应随时间变化的图，A为富含甘油三酯的茶油水解反应后的各脂类组成，B为富含甘油二酯的油脂水解反应后的各脂类组成，C为富含甘油二酯:单甘油酯(l:lv/v)的油脂水解反应后的各脂类组成。
[0045]图14为脂肪酶催化植物油水解的标准色谱图。
【具体实施方式】
[0046]下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0047]实施例1
[0048]偏甘油酯脂肪酶MAJl毕赤酵母表达载体的构建
[0049]根据Genbank的两面神菌HTCC2649偏甘油脂肪酶majl基因(GenBank登录号:WP_009776835)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根据毕赤酵母密码子偏好性对序列进行优化(序列SEQ ID NO:1)。基因合成后，利用下面引物扩增成熟肽序列，
[0050]MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCCGTTG-3’
[0051](SEQ ID NO:3)
[0052]MAJl Rev 5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’
[0053](SEQ ID NO:4)
[0054]PCR扩增条件-MV 5min ；94°C 20s, 53°C 30s, 72°C 80s, 25 个循环；72°C 7min。PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶KpnI和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZ a A(购自Invitrogen)进行双酶切消化,连接,转化至大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞。涂布于LB (含25ug/mlZeOCin)平板。挑取阳性克隆通过Kpn I和Sal I双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了 pGAPZ a A-MAJl表达质粒。
[0055]实施例2[0056]脂肪酶MAJl的重组表达及纯化
[0057] 将脂肪酶MAJl表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至毕赤酵母X_33(购自Invitrogen)感受态态细胞。将转化液涂布于YPD (lOOug/mLZeocin)平板，30°C培养3天后，挑取平板上单菌落于IOOmL YPD培养基中发酵72小时后，离心并浓缩发酵液进行SDS-PAGE检测，获得能够表达脂肪酶MAJl阳性重组菌株。
[0058]将重组菌株接种至IOOmL YPD培养基中，30°C，200rpm振荡培养48-72小时后，收集发酵上清液(10, OOOrpm,离心20min,4°C )。
[0059]将MAJl重组菌株的发酵上清液用0.45 μ m的滤膜抽滤。后用IOkD膜胞(Vivaf low200, Sartorius, Germany)将发酵液置换成20mM pH7.4含30mM咪唑的憐酸盐缓冲液，并将发酵液浓缩到大约30mL。浓缩发酵上清利用镍金属螯合亲和层析柱(HisTrap HPcolumn, GE Healthcare),流速lmL/min,最后用20mM pH7.4含500mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱目标蛋白。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(见图11)。
[0060]实施例3
[0061]最适温度及温度稳定性
[0062]温度对MAJl脂肪酶酶活的影响:在不同温度(5°C -50°C )条件下，采用比色法测定MAJl酶活。反应体系包括IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)，ImM对硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenol caprylate, p-NPc), 10 μ L 酶液,各温度下反应 5min,测定 405nm 处的吸光值0D4(i5。温度对MAJl酶活的影响用相对酶活表示,测定的最大酶活定为100%。所有实验重复三次。结果表明MAJl的最适反应温度是30°C，在25°C达到了 80%的相对酶活(见图3)。
[0063]测定MAJl在不同温度条件下的稳定性时，首先将MAJl在不同的温度(20°C、30°C和40°C )条件下温育，分别在0.5h、lh、l.5h、2h和3h取样，采用比色法测定其剩余酶活。温度对MAJl稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100%。所有实验重复三次。结果表明MAJl在20°C -30°C处理3h后，MAJl能保持95%以上的脂肪酶酶活力。表明MAJl是一个低温稳定脂肪酶(见图5)。
[0064]实施例4
[0065]最适pH及pH稳定性
[0066]pH对MAJl酶活的影响:在不同ρΗ(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)条件下，采用比色法测定MAJl酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。使用的各种pH溶液为:IOOmM NaAc-HAc 溶液(ρΗ3.0、ρΗ4.0、ρΗ5.0)，IOOmMNa2HPO4-NaH2PO4 溶液(ρΗ6.0, ρΗ7.0)，50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)。pH对MAJl酶活的影响用相对酶活来表示，测定的最大酶活定为100%。所有实验重复三次。结果表明MAJl的最适pH值是7.0 (见图4)。
[0067]测定MAJl在不同pH条件下的稳定性时，首先将MASl在不同的ρΗ(3.0、4.0、5.0、
6.0,7.0,8.0和9.0)条件下放置12h，测定MAJl的剩余酶活力。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。pH对MAJl稳定性的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100%。所有实验重复三次。结果表明MAJl在PH3.0-9.0处理2h后，MAJl在pH6.0-9.0保持90%以上的脂肪酶酶活。表明MAJl是一个偏碱性的脂肪酶(见图6)。
[0068]实施例5
[0069]橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活[0070]在对照组和实验组的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4% PVA溶液:橄榄油，3:1)4.0OmL和相应pH值缓冲液5.0OmL,对照组中加入95%乙醇15.0OmL,在特定温度下水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.0OmL,在特定温度水浴中准确反应15min，在实验组中立即补加95%乙醇15.0OmL终止反应，取出。对照组和实验组溶液在自动滴定仪下用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定，以滴定曲线的拐点为滴定终点，记录消耗NaOH标准溶液的体积，按下式计算酶活力。
[0071 ] X= (V — VO) X 1/15XηXc/0.05X50 = 200X (V - VO) XnXc/33-1
[0072]其中:X为样品的酶活力(U/mL)；
[0073]V为滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；
[0074]VO为滴定空白时消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；
[0075]c为NaOH标准溶液浓度(mol/L)；
[0076]0.05为NaOH标准溶液浓度换算系数；
[0077]50为0.5mol/LNa0H标准溶液1.0OmL相当于脂肪酸50 μ mo I ；
[0078]15为反应时间(min)；
[0079]η为稀释倍数。 [0080]脂肪酶活力的定义为:lmL酶液于特定温度与pH值的条件下，水解脂肪每分钟产生I微摩尔(ymol)的脂肪酸所需的酶量即为I个脂肪酶单位，以U/mL表示。
[0081]结果表明MAJl在以橄榄油为底物的反应中的最适温度为40°C，最适pH值是7.0(见图7和图8)。
[0082]实施例6
[0083]大豆卵磷脂法测定磷脂酶酶活
[0084]在对照组和实验组的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4 %无油磷脂溶于0.5 %PVA) 25.0OmL，对照组中加入95%乙醇15.00mL，在特定温度下水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.00mL，在特定温度水浴中准确反应15min，在实验组中立即补加95%乙醇15.0OmL终止反应，取出。空白和样品溶液在自动滴定仪下用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定，以滴定曲线的拐点为滴定终点，记录消耗NaOH标准溶液的体积，按下式计算酶活力。
[0085]计算公式X = (V — V0) *c*50*n/ (0.05*t) = 103* (V — V0) *c*n/t 式 2-1
[0086]其中:X —样品的酶活力，U/mL ；
[0087]V 一滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积，ml ；
[0088]VO 一滴定空白时消耗的NaOH标准溶液体积，ml ；
[0089]c - NaOH标准溶液的浓度，mol/L ；
[0090]50 - 0.05mol/L NaOH 标准溶液 1.0Oml 相当于脂肪酸 50 μ mo I ；
[0091]η 一酶液样品的稀释倍数；
[0092]t 一测定酶活时的反应时间。
[0093]磷脂酶酶活力定义为:在特定条件下Imin水解磷脂产生I微摩尔(μ mol)量游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位(U)。Lecitase? Ultra为液体酶制剂,其磷脂酶活力表示为每mL酶液所测得的磷脂酶活力单位，即U/mL。
[0094]结果表明MAJl在以大豆卵磷脂为底物的反应中的最适温度为30°C,最适pH值是
7.0(见图9和图10)。[0095]实施例7
[0096]MAJl的脂肪酸底物链长选择性
[0097]不同脂肪酸链长的ImM对硝基苯酚酯作为底物，采用比色法测定歐Jl酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例3。不同链长底物对MAJl酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100%。所有实验重复三次。结果表明MAJl对ClO底物的水解活性最大(见图12)。
[0098]实施例8
[0099]偏甘油酯对TAG、DAG和MAG的水解
[0100]在25mL具塞三角瓶中加入3mL的茶油底物和来源于茶油的甘油二酯，单甘油酯(纯度达到96%以上)，加入经纯化后的MAJl，加酶量为100U/mL(U/v，相对于油脂体积)酶液，酶液利用20mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至lmL，混合均匀后预热20min。反应温度为30°C，摇床转速为200rpm,反应过程中分别在0.5h, lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h及12h进行取样。将所取10 μ L样品溶于ImL的流动相中，流动相的比例为:正己烷/异丙醇/甲酸=15:1:0.003 (体积比)，震荡均匀后，于10，OOOrpm下离心5min，除去下层水相，将上层有机相用0.45 μ m的有机相滤膜过滤后，取10 μ L进行HPLC分析。
[0101]HPLC 检测的条件为:色谱柱为 Luna5u SilicalOOA, 250X4.60mm(phenomenex),流动相为正己烷:异丙醇:甲酸=15:1:0.003(体积比)；流动相流速为1.0mL/min，柱温保持30°C;进样量为10 μ L，每个样品检测时间约为30min，数据处理软件为Breeze工作站。脂肪酶MAJl对不同底物进行水解反应后各脂类组分含量的变化(见图13)。在脂肪酶MAJl催化的水解甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)反应中，甘油三酯的含量没有变化，表明脂肪酶MAJl不能催化水解TAG。在脂肪酶MAJl催化的水解甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)和甘油二酯:单甘油酯(monoacylglycerol，MAG) (1:1，v/v)的反应中，MAJl倾向于水解
I,3位甘油二酯生成I位或者3位单甘油酯(1/3-monoacylglycerol, 1/3-MAG)及自由脂肪酸(free fatty acids, FFAs)。表明脂肪酶MAJl是一个1，3位特异性偏甘油酯脂肪酶,可应用于特异性的出除位于I或者3位甘油酯上的脂肪酸。
[0102] 总之，MAJl作为一个低温偏甘油酯脂肪酶，同时具有相当的磷脂酶酶活，可应用于植物油精炼过程中的酶法脱胶和去除偏甘油酯，用于制备高纯度的甘油三酯。同时，也可应用于油脂改性。
【权利要求】
1.一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.一种偏甘油酯脂肪酶基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
3.包含权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的脂肪酶基因。
5.一种偏甘油酯脂肪酶重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备偏甘油酯脂肪酶表达质粒: a.人工合成权利要求2的基因序列； b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶KpnI和SalI分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 a感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒； (2)利用表达质粒制备重组菌株: a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶BlnI线性化后，电转至宿主细胞； b.将转化液涂布于含有100mg/mlZeocin的YPD平板中，30°C培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR的引物序列如下:
MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3’
MAJl Rev 5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母 X_33 (Pichia pastoris)。
8.权利要求5或6或7所述的方法制备的重组菌株。
9.权利要求1所述脂肪酶的应用，其特征在于，该脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯，或用于植物油精炼过程中的酶法脱胶。
10.一种生产权利要求1所述的脂肪酶的方法，其特征在于，包括:培养权利要求4所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。
【文档编号】C12N1/19GK103966187SQ201410182887
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王永华, 元冬娟, 蓝东明, 王方华, 杨博 申请人:华南理工大学