一种dna分子及其在制备糖尿病鼠模型中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种DNA分子及其在制备糖尿病鼠模型中的应用。本发明提供了一种DNA分子，包括表达盒甲和表达盒乙，所述表达盒甲用于表达猪HSD11B1基因，所述表达盒乙用于表达CHOP基因和hIAPP基因；所述猪HSD11B1基因编码序列表的序列3所示的蛋白质；所述CHOP基因表达序列表的序列4所示的蛋白质；所述hIAPP基因编码序列表的序列5所示的蛋白质。使用时，可以借助一个重组载体对三个基因共转化，引起小鼠胰岛β细胞启动凋亡应激相关通路，进而使胰岛β细胞数量减少，导致胰岛素分泌绝对不足，加上HSD11B1引起的胰岛素抵抗作用，产生明显糖耐量低减，最终很可能出现小鼠空腹血糖持续走高，发生糖尿病，达到建模目的。
【专利说明】—种DNA分子及其在制备糖尿病鼠模型中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种DNA分子及其在制备糖尿病鼠模型中的应用。
【背景技术】
[0002]医学研究需要大量建立与人类疾病病理相关的动物模型。能够模拟和体现2型糖尿病病理变化的动物模型将有助于人们更好地理解疾病的本质，为2型糖尿病的预防和治疗提供理论基础，可为药物靶点筛选、新药开发、新型治疗方式的发现提供试验对象。
[0003]使用基因工程技术制备小鼠和小型猪等动物模型，对动物模型的基因组加以改造，可通过转入相关基因，并使之上调表达的方法建模，在胰岛素抵抗与胰岛素分泌缺陷双途径模拟研究人类2型糖尿病，比其他方法制备的动物模型更理想。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种DNA分子及其在制备糖尿病鼠模型中的应用。
[0005]本发明提供了一种DNA分子，包括表达盒甲和表达盒乙，所述表达盒甲用于表达猪HSDlIBl基因，所述表达盒乙用于表达CHOP基因和hIAPP基因；所述猪HSDlIBl基因编码序列表的序列3所不的蛋白质；所述CHOP基因表达序列表的序列4所不的蛋白质；所述hIAPP基因编码序列表的序列5所不的蛋白质。
[0006]所述猪HSD11B1基因具体可如序列表的序列I自5’末端第3327-4205位核苷酸所示。所述CHOP基因具体可如序列表的序列I自5’末端第7592-8095位核苷酸所示。所述hIAPP基因具体可如序列表的序列I自5’末端第8180-8449位核苷酸所示。
[0007]所述表达盒甲中，可由PAPOE启动子启动所述猪HSD11B1基因的表达。所述表达盒乙中，可由PIP启动子启动所述CHOP基因和所述hIAPP基因的表达。
[0008]所述PAPOE启动子具体可如序列表的序列I自5’末端第1675-3311位核苷酸所示。所述PIP启动子具体可如序列表的序列I自5’末端第6102-7591位核苷酸所示。
[0009]所述DNA分子自上游至下游依次可包括如下元件:绝缘子、所述PAPOE启动子、所述猪HSD11B1基因、BGHpA加尾信号、所述绝缘子、所述PIP启动子、所述CHOP基因、F-2A序列、所述hIAPP基因、所述BGHpA加尾信号；所述绝缘子如序列表的序列I自5’末端第7-1674位核苷酸所示；所述PAPOE启动子如序列表的序列I自5’末端第1675-3311位核苷酸所不；所述BGHpA加尾信号如序列表的序列I自5’末端第4209-4433位核苷酸所不；所述PIP启动子如序列表的序列I自5’末端第6102-7591位核苷酸所示；所述F-2A序列如序列表的序列I自5’末端第8096-8179位核苷酸所不。
[0010]所述DNA分子具体可为如下(a)或(b): (a)序列表的序列I自5’末端第7-8674位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列I自5’末端第7-8832位核苷酸所示的DNA分 子。
[0011]含有所述的DNA分子重组载体、表达盒或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。[0012]所述重组载体具体可为在pcDNA3.1 (+)载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。
[0013]所述重组载体具体可为将PCDNA3.1 (+)载体Mul I和Not I酶切位点之间的小片段(PCMV片段)取代为所述DNA分子得到的重组质粒。
[0014]本发明还保护以上任一所述的DNA分子或重组载体的应用，为如下(I)或(2)或
(3)或(4):(1)制作糖尿病鼠模型；(2)诱发小鼠发生胰岛素抵抗；(3)制备用于制作糖尿病鼠模型的试剂盒；(4)制备用于诱发小鼠发生胰岛素抵抗的试剂盒。
[0015]本发明还保护一种试剂，包括以上任一所述的DNA分子或重组载体；所述试剂的用途为如下⑴或⑵或(3)或(4):(1)制作糖尿病鼠模型；(2)诱发小鼠发生胰岛素抵抗；(3)制备用于制作糖尿病鼠模型的试剂盒；(4)制备用于诱发小鼠发生胰岛素抵抗的试剂盒。
[0016]所述糖尿病鼠模型为满足如下条件的小鼠:空腹血糖值高于≥6.7mmol/L且糖耐量试验120min时刻血糖值> 10.lmmol/L。
[0017]本发明通过肝脏特异性启动子启动HSD11B1过表达，通过胰腺特异启动子启动CHOP基因和hIAPP基因的过表达且使其与胰岛素表达的时空特异性保持一致(通过Furin裂解位点和自剪切多肽2A连接实现两个基因的共表达，两个基因在一个第二个表达盒内，同时在表达盒间用MAR insulator隔开,绝缘子阻隔双启动子间可能存在的相互影响可能导致基因表达不稳定的弊端。使用时，可以借助一个重组载体对三个基因共转化，也避免了多质粒共转化系统中，多载体转化效率问题和多种抗生素选择而带来的繁琐)，引起小鼠胰岛β细胞启动凋亡应激相 关通路，进而使胰岛β细胞数量减少，导致胰岛素分泌绝对不足，加上HSD11B1引起的胰岛素抵抗作用，产生明显糖耐量低减，最终出现小鼠空腹血糖持续走高，发生糖尿病，达到建模目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1 为重组质粒 pcDNA3.1-PAPOE-HSDIlBl-PIP-CHOP-hIAPP 的结构示意图。
[0019]图2为实施例2中，Fl代幼龄转基因小鼠肝脏中HSD11B1基因的相对表达量、胰腺内CHOP基因的相对表达量和胰腺内hIAPP基因的相对表达量。
[0020]图3为实施例2中，FO代成年龄转基因小鼠肝脏中HSD11B1基因的相对表达量、胰腺内CHOP基因的相对表达量和胰腺内hIAPP基因的相对表达量。
[0021 ] 图4为实施例2中，从饲喂高脂高糖的第一天开始计时，O时刻、I个月后、2个月后和3个月后小鼠的平均体重。
[0022]图5为实施例2中，从饲喂高脂高糖的第一天开始计时，O时刻和2个月后糖耐量试验的结果。
[0023]图6为实施例2中，小鼠空腹血糖值和糖耐量试验120min时刻血糖值。
【具体实施方式】
[0024]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0025]pcDNA3.1(+)载体:Invitrogen, Catalog nos.V790-20。
[0026]pEGFP-Nl 载体:BD Biosciences/Clontech, Catalog#6085_l。
[0027]Lipofectamine?2000 (脂质体):Invitrogen。
[0028]C57BL/6J小鼠:购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
[0029]第一对引物如下:
[0030]PAPOE-1lb F:5’-GCTCCCTTTCCCCCTTAACC-3’ ；
[0031]PAPOE-1lb R:5’-AGGCCAAGAAGATCCCCAGA-3’。
[0032]第二对引物如下:
[0033]PIP-CHOP F:5’-AGGGAAATGATCCAGAAAGTGC-3’ ；
[0034]PIP-CH OP R:5，-GGACGCAGGGTCAAGAGTAGTG-3，。
[0035]第三对引物对如下:
[0036]CHOP-hlAPP F:5’-GAAACGGAAACAGAGTGG-3’ ；
[0037]CHOP-hlAPP R:5’-GTTGCTGGAATGAACTAAAA-3’。
[0038]实施例1、重组质粒 pcDNA3.1 -PAPOE-HSD IlBl-P I P-CH0P-h IAPP 的构建
[0039]1、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子。
[0040]序列表的序列I中，自5 ’末端第1-6位核苷酸为限制性内切酶Mlu I的识别序列，第7-1674位核苷酸为MAR insulator (绝缘子)，第1675-3311位核苷酸为PAPOE启动子，第3312-4208位核苷酸为猪HSD11B1基因(其中，第3327-4205位核苷酸为开放阅读框)，第4209-4433位核苷酸为BGHpA加尾信号，第4434-6101位核苷酸为MARinsulator (绝缘子)，第6102-7591位核苷酸为PIP启动子，第7592-8095位核苷酸为小鼠CHOP基因，第8096-8179位核苷酸为F-2A序列(其中，第8096-8107位为Furin酶裂解位点的氨基酸“RAKR”的编码序列，第8108-8179位核苷酸为2A自剪切多肽的编码序列)，第8180-8449位核苷酸为hIAPP基因(来源于人的IAPP基因)，第8450-8674位核苷酸为BGHpA加尾信号，第8833-8840位核苷酸为限制性内切酶Not I的识别序列。
[0041]2、用限制性内切酶Mul I和Not I双酶切步骤I得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
[0042]3、用限制性内切酶Mul I和Not I双酶切pcDNA3.1 (+)载体，回收约4.7kb载体骨架。
[0043]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒
[0044]pcDNA3.1 -PAPOE-HSD IlBl-P IP-CH0P-h IAPP ? 重组质粒
[0045]pcDNA3.1 -PAPOE-HSD IlBl-P I P-CH0P-h IAPP 的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示，结构示意图见图1。
[0046]实施例2、转基因小鼠的制备和鉴定
[0047]一、转基因小鼠的制备
[0048]1、用限制性内切酶Sca I单酶切重组质粒
[0049]pcDNA3.1 -PAPOE-HSD IlBl-P I P-CH0P-h IAPP (线性化)，得到线性 DNA 分子。
[0050]2、回收步骤I得到的线性DNA分子，注射入受精卵(C57BL/6J雌鼠和C57BL/6J雄鼠的受精卵)中，然后移入C57BL/6J孕鼠(受体小鼠)，饲养受体小鼠至其自然生产，得到的子代鼠为FO代小鼠。
[0051]3、剪取H)代小鼠的尾巴，提取基因组DNA，进行PCR鉴定(分别采用如下三对引物进行 PCR 鉴定:PAP0E-llb F 和 PAPOE-1lb R 组成的引物对、PIP-CHOP F 和 PIP-CH0PR 组成的引物对、CHOP-hlAPP F和CHOP-hlAPP组成的引物对；如果采用上述三对引物进行PCR鉴定的结果均为阳性，待测小鼠为转基因小鼠)。
[0052]4、取H)代转基因小鼠公鼠，每只公鼠与2只C57BL/6J雌鼠进行自然交配，雌鼠自然生产，得到的子代鼠为Fl代小鼠。
[0053]5、剪取Fl代小鼠的尾巴，提取基因组DNA，进行PCR鉴定(PCR鉴定的引物对同步骤3，如果采用三对引物进行PCR鉴定的结果均为阳性，待测小鼠为转基因小鼠)。
[0054]6、分别取Fl代幼龄(7周龄，即1.5月龄)与H)代成年龄(34周龄，即8月龄)的转基因小鼠(将C57BL/6J小鼠作为阴性对照)的肝脏、胰腺，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过荧光定量PCR分别鉴定肝脏中HSDlIBl基因的相对表达量、胰腺内CHOP基因的相对表达量和胰腺内hIAPP基因的相对表达量。 [0055]用于鉴定HSD11B1基因的引物对如下:
[0056]11β 35-F:5’-AGACACAGACACGGCCATGA-3’ ；
[0057]11β 35-R:5’-TTCGGAGATGGTTGTACGTTGA-3’。
[0058]用于鉴定CHOP基因的引物对如下:
[0059]CHOPzhuz1-F:5，-TGCCTTTCACCTTGGAGACGG-3’ ；
[0060]CHOPzhuz1-R:5’ -AGGGCTTTGGGATGTGCGTGT-3’。
[0061]用于鉴定hIAPP基因的引物对如下:
[0062]IAPP75short-F:5’-TGAAAGTCATCAGGTGGAAAAGC-3’ ；
[0063]IAPP75short-R:5’-AGGCGCTGCGTTGCA-3’。
[0064]用于鉴定GAPDH基因的引物对如下:
[0065]GAPDH-F: 5’-CATGTTCCAGTATGACTCCACTC-3’ ；
[0066]GAPDH-R:5’-GGCCTCACCCCATTTGATGT-3’。
[0067]Fl代幼龄转基因小鼠结果见图2。结果表明，转基因小鼠肝脏中HSD11B1基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠，转基因小鼠胰腺内CHOP基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠，转基因小鼠胰腺内hIAPP基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠。
[0068]FO代成年龄转基因小鼠的结果见图3。结果表明，转基因小鼠肝脏中HSD11B1基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠，转基因小鼠胰腺内CHOP基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠，转基因小鼠胰腺内hIAPP基因的相对表达量显著高于C57BL/6J小鼠。
[0069]以上结果表明，重组质粒pcDNA3.1 -PAPOE-HSD IlBl-P I P-CH0P-h IAPP在小鼠个体水平得到了理想的表达。
[0070]二、通过糖耐量检测判断胰岛素抵抗
[0071]正常饲料:DIOdiet#D12450K (Research Diets, Inc., New Brunswick, USA) ?
[0072]高脂高糖饲料:D10diet#D12451 (Research Diets, Inc., New Brunswick, USA) ?
[0073]1、分组处理
[0074]第一组(Tg HF-HG):采用正常饲料饲喂Fl代雄性转基因小鼠至13周龄，然后采用闻脂闻糖词料词喂；[0075]第二组(Ng HF-HG):采用正常饲料饲喂雄性C57BL/6J小鼠至13周龄，然后采用闻脂闻糖词料词喂；
[0076]第三组(Tg Control):采用正常饲料代替饲高脂高糖饲料进行第一组的平行实验;
[0077]第四组(Ng Control):采用正常饲料代替饲高脂高糖饲料进行第二组的平行实验。
[0078]2、体重比较
[0079]步骤I中，从饲喂高脂高糖的第一天开始计时，O时刻、I个月后、2个月后和3个月后小鼠的平均体重见图4。图4中，各组的结果均为5只公鼠的平均值。图4的结果表明:在高脂高糖诱导的情况下，转基因小鼠的体重显著高于C57BL/6J小鼠；在饲喂正常饲料的情况下，转基因小鼠的体重也显著高于C57BL/6J小鼠。
[0080]3、血糖耐受比较
[0081]糖耐量试验(IPGTT)的方法:先使小鼠空腹12h，然后通过腹腔注射给予1% (质量比)体重的D-葡萄糖(采用生理盐水作为溶剂)，以注射时刻为起点，在0min、15min、30min、45min、60min、90min和120min时刻测定鼠尾血糖值。
[0082]步骤I中，从 饲喂高脂高糖的第一天开始计时，O时刻和2个月后糖耐量试验的结果见图5。
[0083]图5A为分组处理O时刻的糖耐量试验结果，图5B为基于图5A得到的糖耐量曲线下面积(AUC)，糖耐量曲线下面积越大说明胰岛素抗性越大。
[0084]图5C为分组处理2个月后的糖耐量试验结果，图为基于图5C得到的糖耐量曲线下面积(AUC)，糖耐量曲线下面积越大说明胰岛素抗性越大。
[0085]图5的结果表明，饲喂高脂高糖饲料2个月后，转基因组小鼠已经明显的发生了胰岛素抵抗，且程度显著高于饲喂高脂高糖饲料同期C57BL/6J小鼠。
[0086]图5中，各组的结果均为5只公鼠的平均值。图5的结果表明，转基因小鼠在高糖高脂饲料诱导下注射D-葡萄糖后的血糖值整体高于对照小鼠，即葡萄糖耐受能力下降，发生了胰岛素抵抗。
[0087]4、空腹血糖值和糖耐量试验120min时刻血糖值
[0088]步骤I中，从饲喂高脂高糖的第一天开始计时，分别检测O时刻、2个月后和4个月后转基因小鼠的空腹血糖值(空腹即连续12小时未进食，检测鼠尾血糖)，结果见图6A (虚线代表6.7mmol/L,B图代表10.lmmol/L)。步骤I中，从饲喂高脂高糖的第一天开始计时，分别记录O时刻、2个月后和4个月后转基因小鼠糖耐量试验120min时刻血糖值(糖耐量试验120min时刻血糖值简称120min时刻血糖值)，方法如下:先使小鼠空腹12h，然后通过腹腔注射给予I % (质量比)体重的D-葡萄糖(采用生理盐水作为溶剂)，以注射时刻为起点，在120min时刻测定鼠尾血糖值，结果见图6B(虚线代表10.lmmol/L)。
[0089]结果见表1。
[0090]表1空腹血糖值和糖耐量试验120min时刻血糖值(mmol/L)
[0091]
【权利要求】
1.一种DNA分子，包括表达盒甲和表达盒乙，所述表达盒甲用于表达猪HSDlIBl基因，所述表达盒乙用于表达CHOP基因和hIAPP基因；所述猪HSDlIBl基因编码序列表的序列3所不的蛋白质；所述CHOP基因表达序列表的序列4所不的蛋白质；所述hIAPP基因编码序列表的序列5所不的蛋白质。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述猪HSD11B1基因如序列表的序列.1自5’末端第3327-4205位核苷酸所示；所述CHOP基因如序列表的序列I自5’末端第.7592-8095位核苷酸所示；所述hIAPP基因如序列表的序列I自5’末端第8180-8449位核苷酸所示。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述表达盒甲中，由PAPOE启动子启动所述猪HSD11B1基因的表达；所述表达盒乙中，由PIP启动子启动所述CHOP基因和所述hIAPP基因的表达。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于:所述PAPOE启动子如序列表的序列I自5’末端第1675-3311位核苷酸所示；所述PIP启动子如序列表的序列I自5’末端第.6102-7591位核苷酸所示。
5.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子自上游至下游依次包括如下元件:绝缘子、所述PAPOE启动子、所述猪HSDIIBI基因、BGHpA加尾信号、所述绝缘子、所述PIP启动子、所述CHOP基因、F-2A序列、所述hIAPP基因、所述BGHpA加尾信号；所述绝缘子如序列表的序列I自5’末端第7-1674位核苷酸所示；所述PAPOE启动子如序列表的序列I自5’末端第1675-3311位核苷酸所不；所述BGHpA加尾信号如序列表的序列I自5’末端第4209-4433位核苷酸所示；所述PIP启动子如序列表的序列I自5’末端第6102-7591位核苷酸所示；所述F-2A序列如序列表的序列I自5’末端第8096-8179位核苷酸所示。
6.如权利要求5所示的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为如下(a)或(b): (a)序列表的序列I自5’末端第7-8674位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列I自5’末端第7-8832位核苷酸所示的DNA分子。
7.含有权利要求1至6中任一所述的DNA分子重组载体、表达盒或转基因细胞系。
8.如权利要求7所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将pcDNA3.1 (+)载体Mul I和Not I酶切位点之间的小片段取代为所述DNA分子得到的重组质粒。
9.权利要求1至6中任一所述的DNA分子、权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的重组载体的应用，为如下⑴或⑵或⑶或⑷: (1)制作糖尿病鼠模型； (2)诱发小鼠发生胰岛素抵抗； (3)制备用于制作糖尿病鼠模型的试剂盒； (4)制备用于诱发小鼠发生胰岛素抵抗的试剂盒。
10.一种试剂，包括权利要求1至6中任一所述的DNA分子、权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的重组载体；所述试剂的用途为如下(I)或(2)或(3)或(4): (1)制作糖尿病鼠模型； (2)诱发小鼠发生胰岛素抵抗； (3)制备用于制作糖尿病鼠模型的试剂盒； (4)制备用于诱发小鼠发生胰岛素抵抗的试剂盒。
【文档编号】C12N15/85GK103966243SQ201410189076
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】杨述林, 孔思远, 阮进学, 辛磊磊, 李奎 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所