一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibrio?sp.S-3)及其应用，该短蛸胃肠道产蛋白酶菌株于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC?No.8299。本发明的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面以及生产酶解豆粕的蛋白酶方面的应用。本发明筛选到的产蛋白酶菌株Vibrio?sp.S-3能高效地产生蛋白酶，用于洗涤剂添加剂，酶解豆粕，提高了资源利用率，降低了生产成本。
【专利说明】一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是作用于蛋白质或多肽催化肽键水解的水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，具有催化能力高、反应条件温和、底物专一性等特点。蛋白酶的销售额约占全球酶制剂市场的60 %，对经济的发展起着重要的作用。蛋白酶广泛分布于动物、植物、微生物中。通过微生物发酵产生的蛋白酶我们把它称之为微生物蛋白酶，与菠萝、木瓜、猪胰脏等传统的动植物资源相比，微生物蛋白酶资源具有无法比拟的优势。随着基因工程的加入、发酵技术的发展、酶制剂的广泛应用及新型发酵设备的发明，微生物成为工业用蛋白酶的主要来源。蛋白酶的用途非常广泛，最大的用途是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿酒酿造，以及制革工业和医药。全世界洗涤剂的年产量已达1.3亿吨，在欧洲加酶洗衣粉的比例达到80%左右，美国45%的 洗涤剂加酶，日本加酶的洗衣粉比例也达60%以上，全世界碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的25%。
[0003]我国是世界上最大的养殖生产国、饲料原料(特别是蛋白质原料)需求大国之一，但是我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源的严重不足，鱼粉等高品质动物蛋白原料主要依赖国际进口，而目前全球性鱼类资源的日趋减少直接导致鱼粉价格上涨，动物蛋白价格高涨使得人们将视线逐渐转向了植物蛋白。豆柏作为一种质量稳定的植物蛋白原料，一直是饼柏消费的主体，加之动物性蛋白资源日益短缺，价格居高不下，促使豆柏植物性蛋白原料需求的扩大。但由于豆柏中抗营养因子的存在以及其适口性差等问题限制了豆柏的应用价值。
[0004]目前，我国的蛋白酶研究还存在蛋白酶种类单一、微生物来源较少等问题，因此寻找和开发新的微生物蛋白酶来源是目前科研的重点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用，旨在解决我国蛋白酶研究还存在蛋白酶种类单一、微生物来源较少等问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibrio sp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC N0.8299，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。该短蛸胃肠道产蛋白酶菌株的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，该菌株为革兰氏阴性菌，菌落为乳白色、圆形、平整、边缘整齐湿润的光滑小菌落。
[0007]本发明进一步提供上述短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面的应用。
[0008]本发明进一步提供上述短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产酶解豆柏的蛋白酶方面的应用。
[0009]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明从短蛸胃肠道内筛选了一种产蛋白酶菌株Vibrio sp.S-3，高效地产生蛋白酶，用于洗涤剂添加剂，酶解豆柏，提高了资源利用率，降低了生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例1中各菌株发酵液的蛋白酶活力图；
[0011]图2为本发明实施例1中Vibrio sp.S_3系统发育树；
[0012]图3为本发明实施例2中不同碳源对Vibrio sp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；
[0013]图4为本发明实施例2中不同氮源对Vibrio sp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；
[0014]图5为培养基起始pH值对Vibrio sp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；
[0015]图6为本发明实施例2中培养温度对Vibrio sp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响图；
[0016]图7为本发明实施例2中培养时间对Vibrio sp.S_3菌株产蛋白酶活力的影响图。【具体实施方式】
[0017]以往人们多从土壤、温泉水中采集样本筛选产蛋白酶微生物，近年来，人们逐渐将开发利用的眼光投向海洋。海洋特有的环境造就了海洋生物的多样性与独特性，低温、高压、高盐量使得海洋生物中一些酶、激素以及其他代谢产物有着极高的活性,海洋生物也将成为各国学者研究的主要对象。章鱼属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)、章鱼科(octopodidae),学名“蛾”。其体短，卵圆形，无鳍，头上生八腕，腕长短不等，腕间有膜相连，腕上吸盘无柄。根据腕的长短，章鱼主要分为8种，分别为短蛸、卵蛸、双点蛸、真蛸、环蛸、长蛸、纺锤蛸、嘉庚蛸。本发明所选用的章鱼为短蛸(Octopusocellatus)，属软体动物门、头足纲、八腕目、章鱼科、蛸属，主要栖居于温带偏北海域，是我国北方沿岸蛸类中最重要的经济种。
[0018]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]实施例1:Vibrio sp.S-3菌株的制备:
[0020]一、材料与培养基:
[0021]1、材料短蛸
[0022]2、培养基
[0023]选择培养基:2216E培养基，培养基的制备方法详见文献:Christer0.1ntestinalColonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)-and Dab(LimandaIimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against VibrioanguiIlarum[J].APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1992(58):551-556.；
[0024]酪蛋白培养基:酪蛋白1%，酵母膏0.1%，琼脂1.5%，pH7.2，海水配制，以上为质量浓度，即酪蛋白为lg/100mL ； [0025]液体发酵培养基:淀粉0.5 %，蛋白胨0.5 %，酵母膏0.1%，磷酸高铁0.0I %，培养基起始PH8.0，该培养基用海水配制，以上为质量浓度，即淀粉为0.5g/100mL ；
[0026]固体培养基:称取4gLB营养琼脂培养基溶解于100mL海水中。
[0027]二、短蛸胃肠道产蛋白酶菌的筛选:
[0028]选用酪蛋白培养基作为筛选培养基的原理是产蛋白酶菌种在酪蛋白培养基中生长时，产的蛋白酶可水解培养基中的酪蛋白，产生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小可进行产蛋白酶菌株的筛选。
[0029]1、初筛
[0030]将活短蛸解剖，取其胃肠道，去掉肠道杂物，用无菌海水冲洗数次，匀浆，得到菌液原液，将原液稀释成10_\ 10_2浓度梯度，分别涂布于2216E培养基，于25°C恒温培养箱中培养。
[0031]挑取培养基上的单菌落，稀释划线培养于固体培养基上，25°C培养ld，得到纯的单菌落，将单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况。
[0032]结果:酪蛋白培养基上水解透明圈直径与菌落直径的比值(D/d值)越大说明产酶能力越强。菌株的初筛共得到10株在酪蛋白培养基上产透明圈的菌株，记为S-1，
S-2，......，S-10，其中，菌株S-l、S-2、S-3和S-8所产透明圈直径和菌落直径比值较大。
[0033]2、复筛:
[0034]将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25 °C摇瓶培养3d,在4°C,10000r/min条件下离心10min，取上清液，测定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株，作为出发菌株。
[0035]三、蛋白酶活力测定方法:
[0036]参照《SBT10317-1999蛋白酶活力测定法》的福林酚法，配制质量分数为2%酪蛋白溶于0.2mol/LPBS(pH7.2)缓冲液中作为底物，将0.2ml酪蛋白底物和0.2ml样品分别在37°C预热lOmin，充分混匀后，37°C水浴反应lOmin。反应结束后加入0.4mlTCA终止反应，放入37°C水浴锅中静置20min, 10000r/min离心5min,取上清液0.2ml,向上清液中加入ImlNa2CO3和0.2ml福林试剂，37 °C静置水浴20min，结束后660nm下测吸光值，计算酶活力。
[0037]酶活力定义为在40°C，每毫升酶液每分钟催化酪蛋白水解生成I μ g酪氨酸的酶量为I个单位(U/mL)。
[0038]将初筛得到的10株菌株分别接种至液体发酵培养基，进行摇瓶培养，测定其粗酶液的蛋白酶活力，结果见图1所示，S-3菌株产的蛋白酶活性最高，其次为S-1菌株和S-8菌株，蛋白酶活力分别为52，49和35U/mL，综合水解透明圈和酶活力两个因素，选择S-3菌株为出发菌株，进行后续试验。
[0039]四、S-3菌株的鉴定:
[0040] 1、形态特征:
[0041]观察S-3菌株在固体培养基上的生长状况，记录形态特征，通过革兰氏染色观察菌株的个体形态等。
[0042]对培养24h的S-3菌株进行革兰氏染色，在显微镜下观察其形态，S-3菌株为革兰氏阴性菌，短杆状。菌落为乳白色、圆形、平整、边缘整齐湿润的光滑小菌落。
[0043]2、生理生化鉴定[0044]对S-3菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示:
[0045]表1生理生化实验结果
[0046]
【权利要求】
1.一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibrio sp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC N0.8299。
2.权利要求1所述的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面的应用。
3.权利要求1所述 的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产酶解豆柏的蛋白酶方面的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103966132SQ201410195252
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】金玉兰, 王玉荣, 肖 琳 申请人:青岛农业大学