一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，属于微生物和固定化酶【技术领域】。本发明将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEFpr-MEL1，然后转化OSW2基因缺陷型酿酒酵母，通过以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源的条件培养重组酵母，最终收集纯化获得固定化酶。该微胶囊固定化酶一方面可以利用二酪氨酸层将酶包裹在孢子的周质间隙上，同时二酪氨酸层变得疏松后便于底物分子与酶分子进行接触，提高了反应效率。这种独特的空间定位提高了对蛋白酶的稳定性、无需蛋白纯化和固定化操作、降低生产成本等。
【专利说明】一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，属于微生物和固定化酶【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下,生长迅速，以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源等特定条件，如只有乙酸钾存在，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，此时的细胞即称为子囊。子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子。
[0003]0SW2基因的具体功能虽然尚不明确，但是可以肯定的是其对正确组装酿酒酵母孢子壁是必须的。曾有文献报道过敲除0SW2基因后酿酒酵母孢子对乙醚敏感，而野生型孢子对乙醚不敏感。酿酒酵母在以醋酸盐为唯一或主要碳源的状态下在可以产生子囊孢子，其孢子壁由四层组成，从内到外依次为:甘露糖，葡聚糖，壳聚糖，二酪氨酸。
[0004]在本发明中，我们使用一种酿酒酵母缺陷型菌株osw2 Λ，此菌株产生的孢子壁虽然含有最外的二酪氨酸层，但是其孢子壁结构变得疏松，空隙变大，使得某些大小适中的底物可以通过。我们通过分子生物学的方法使目的酶固定在此缺陷型的孢子壁上壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，得到孢子固定化酶，一方面可以利用孢子二酪氨酸层将酶包裹在孢子的周质间隙上，同时二酪氨酸层变得疏松后便于底物分子与酶分子进行接触，提高了反应效率。这 种独特的空间定位使其相对于游离酶而言具有很多优良特性，如温度(有机溶剂、蛋白酶)稳定性、重复使用性、无需蛋白纯化和固定化操作、降低生产成本等。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，是构建0SW2基因缺陷型酿酒酵母，以其为宿主构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。
[0006]所述酶优选α -半乳糖苷酶、蔗糖酶或植酸酶。
[0007]所述方法包括以下步骤:
[0008]I)通过同源重组敲除酿酒酵母孢子壁合成相关基因0SW2，筛选验证得到酿酒酵母缺陷菌株osw2 Δ，其孢子壁二酪氨酸层疏松；
[0009]所述0SW2的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0010]2)将带有自身信号肽的α -半乳糖苷酶基因(MELl)插入到质粒pRS424_TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEFp,-MELl ；
[0011]所述α -半乳糖苷酶基因(MELl)来自酵母，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
[0012]3)将得到的重组质粒PRS424-TEFM-MEL1通过醋酸锂/PEG的转化方法转化酿酒酵母osw2 Λ，得到重组酿酒酵母osw2 Δ /pRS424-TEFpr-MELl ；
[0013]4)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp液体培养基中，28 °C~32°C培养，过夜；所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物；
[0014]5)将步骤3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28°C~32°C摇床12h~16h ;所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾；
[0015]6)离心收集步骤4)中的菌体，清洗，然后用1.5%~3% (m/v)醋酸钾重悬，28°C ~32°C 摇床 24h ~48h ；
[0016]7)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2~3次，然后再用PBS溶液重悬；
[0017]8)向步骤7)中的细胞悬浮液加入lyticase (溶壁酶)，冰上超声；
[0018]9)用PBS溶液将步骤8)的破碎细胞洗2~3次，弃去上清得到酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子微胶囊固定化酶。
[0019]所述培养温度优选30°C，醋酸钾浓度优选2%。
[0020]所述步骤9)还包括对得到的孢子微胶囊固定化酶进行纯化，将得到的孢子微胶囊固定化酶用0.5% Triton X-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在0.5% Triton X-100溶液中；配制不同浓度梯度的Percoll溶液；将不同浓度梯度的Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加入孢子悬浮液，离心后，溶液分层，孢子将会位于离心管的底部，将上层液体和细胞碎片除去，用0.5% Triton X-100溶液洗涤孢子2~3次，并冷冻干燥。
[0021]所述SD-Trp培养基优选 无氨基酸酵母氮源与去离子水的质量百分比为0.67%，葡萄糖终浓度2 %，氨基酸混合物终浓度0.67 %。其中，氨基酸混合物粉末成分及比例如下:
[0022]
【权利要求】
1.一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，其特征在于，构建0SW2基因缺陷型酿酒酵母，以其为宿主，构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是α-半乳糖苷酶，编码所述α -半乳糖苷酶及其自身信号肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酶在信号肽的引导下表达在周质间隙。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述0SW2基因缺陷型酿酒酵母是通过同源重组敲除酿酒酵母孢子壁合成相关基因0SW2，并筛选验证得到；所述0SW2基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将SEQID N0.2所示的带有自身信号肽的α -半乳糖苷酶基因插入到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424_TEFp,-MELl，然后转化0SW2基因缺陷型酿酒酵母osw2 Δ，通过以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源的条件培养重组酵母，最终收集纯化获得酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒 PRS424-TEFM-MEL1 ； (2)将得到的重组质粒pRS424-TEFp,-MELl转化酿酒酵母osw2Δ，得到重组酿酒酵母osw2 Δ /pRS424-TEFpr-MELl ； (3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，28°C~32°C培养，过夜； (4)将步骤(3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28°C~32°C摇床12h~16h； (5)离心收集步骤(4)中的菌体，清洗，然后用1.5%~3%醋酸钾重悬，281:~321:摇床24h~48h,使酿酒酵母在胞内形成孢子； (6)收集、破碎重组酿酒酵母细胞，收集、纯化获得在壳聚糖层和二酪氨酸层之间表达了 α-半乳糖苷酶的孢子。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2~3次，然后再用PBS溶液重悬；向细胞悬浮液加入Lyticase，冰上超声；用PBS溶液将破碎细胞洗2~3次，弃去上清得到重组酿酒酵母孢子。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将收集得到的重组酿酒酵母孢子用Triton X-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在Triton X-100溶液中；利用Percoll分层液，离心获得纯净的孢子，用PBS溶液洗涤孢子2~3次，冷冻干燥。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾。
【文档编号】C12N15/81GK103966196SQ201410199369
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】高晓冬, 中西秀树, 施李兵, 李子杰 申请人:江南大学