一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤：(1)接种：将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的三角瓶中；(2)振荡培养：将经步骤(1)接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为36℃-38℃，摇床转速为180rpm-220rpm，振荡培养时间为5.5h-6.5h；(3)静置培养将经步骤(2)振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为36℃-38℃，静置培养时间为7.5h-8.5h。本发明的目的在于提供一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法。本发明所提供的培养方法可显著提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量。
【专利说明】一种提局禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法。
【背景技术】
[0002]禽霍乱，又名禽出血性败血症、禽巴氏杆菌病或禽摇头瘟等，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的侵害各种禽类的接触性传染病。该病常表现为败血型,发病率和死亡率都很高，也表现慢性型，给世界范围内的养禽业造成重大的经济损失。多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性、无鞭毛、无芽胞的小杆菌，新分离的菌株具有荚膜，荚膜可增强菌株的侵袭力和繁殖能力。
[0003]以含3% -5%的小牛血清和0.25%葡萄糖的马丁肉汤或琼脂培养禽源多杀性巴氏杆菌，提取其荚膜制成禽霍乱荚膜亚单位疫苗，近期免疫保护率为80%以上。该疫苗起免疫原性作用的是一种含蛋白质为主的脂多糖蛋白复合物，其免疫剂量的确定是测定其中的蛋白质含量，临床应用时，8周龄左右鸡、鸭的单位免疫量为1.2mg-l.4mg、鹅的使用量加倍。制备禽霍乱荚膜亚单位疫苗时，选用的培养基是以马丁肉汤为基础，添加小牛血清和葡萄糖制成。培养的方法有固体培养法和液体培养法。固体培养法收获的荚膜较多，成本较低，但固体培养法工艺繁琐，不适合大规模生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法。
[0005]本发明的目的通过如下技术方案实现:一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤:
[0006](I)接种:
[0007]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的0.5% -1.5%，所述培养基的装量为三角瓶容积的3/5-4/5 ；
[0008](2)振荡培养:
[0009]将经步骤(1)接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为36°C _38°C，摇床转速为180rpm-220rpm，振荡培养时间为5.5h_6.5h ；
[0010]⑶静置培养
[0011]将经步骤(2)振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为36°C -38°c，静置培养时间为7.5h-8.5h。
[0012]较之现有技术而言，本发明的优点在于:本发明所提供的培养方法可显著提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例和对比试验对本
【发明内容】
进行详细说明:[0014]一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤:
[0015]⑴接种:
[0016]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的0.5% -1.5%，所述培养基的装量为三角瓶容积的3/5-4/5 ；
[0017](2)振荡培养:
[0018]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为36°C _38°C，摇床转速为180rpm-220rpm，振荡培养时间为5.5h_6.5h ；
[0019]⑶静置培养
[0020]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为36°C _38°C，静置培养时间为7.5h-8.5h。
[0021]荚膜位于禽源多杀性巴氏杆菌的最外层，易受外力的作用而被破坏。将禽源多杀性巴氏杆菌接种于适宜的液体培养基，如果静置培养，外力的干扰小，但生长的细菌较少，故收获的荚膜较少；如果振荡培养，生长的细菌增加，但由于外力的干扰破坏，收获的荚膜也较少。本发明采用先震荡后静置培养，极大提高了荚膜产量，通过上述培养方法提取的荚膜产量比静置培养的方法所得荚膜产量提高了 160%以上，比振荡培养的方法所得荚膜产量提高了 20%以上。
[0022]培养禽源多杀性巴氏杆菌过去是采用马丁肉汤培养基，培养基成本较高，限制了禽源多杀性巴氏杆菌荚膜的产业化发展。
[0023]本发明用NKLB培养基代替传统的马丁肉汤，采用NKLB培养基培养禽源多杀性巴氏杆菌所得到的荚膜量相比于同等条件下用马丁肉汤培养禽源多杀性巴氏杆菌所得到的荚膜量基本相同，而NKLB培养基的生产成本仅为马丁肉汤的三分之一，极大的降低了荚膜的生产成本。
[0024] 所述NKLB培养基每升中包含胰蛋白胨9g_llg ;酵母粉4g_6g ;氯化钠4g_6g ;硝酸钠0.7g-lg ;磷酸氢二钾7g-llg ;小牛血清8mL-12mL ;50%葡萄糖18mL-22mL ;所述降低禽源多杀性巴氏杆菌荚膜生产成本的培养基的pH为7.6-8.2。
[0025]一、实施例如下:
[0026]实施例1:
[0027]—种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤:
[0028](I)接种:
[0029]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)；
[0030](2)振荡培养:
[0031]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为6h ；
[0032](3)静置培养
[0033]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为37°C，静置培养时间为8h。[0034]上述用于培养禽源多杀性巴氏杆菌的培养基制备方法如下:称取胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠(NaCl) 5g、硝酸钠(NaNO3)0.85g、磷酸氢二钾(K2HPO4.3H20) 9.13g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用IM NaOH调pH值为7.8，补足蒸馏水至970mL，于121°C高压灭菌20min，待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清10mL，加入注射用50%葡萄糖20mL，混匀即为NKLB培养基，4°C _8°C保存。
[0035]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.42mg。
[0036]实施例2:
[0037]一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤:
[0038](I)接种:
[0039]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)；
[0040](2)振荡培养:
[0041]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培 养时间为5.5h ；
[0042](3)静置培养
[0043]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为37°C，静置培养时间为8.5h。
[0044]上述用于培养禽源多杀性巴氏杆菌的培养基制备方法如下:称取胰蛋白胨9g、酵母粉4g、氯化钠(NaCl)4g、硝酸钠(NaNO3)0.7g、磷酸氢二钾(K2HPO4.3H20) 7g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用IM NaOH调pH值为7.6，补足蒸馏水至974mL，于121°C高压灭菌20min，待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清8mL，加入注射用50%葡萄糖18mL，混匀即为NKLB培养基，4°C _8°C保存。
[0045]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.40mg。
[0046]实施例3:
[0047]一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，它包括以下步骤:
[0048](I)接种:
[0049]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)；
[0050](2)振荡培养:
[0051]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为6.5h ；
[0052](3)静置培养
[0053]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为37°C，静置培养时间为7.5h。
[0054]上述用于培养禽源多杀性巴氏杆菌的培养基制备方法如下:称取胰蛋白胨llg、酵母粉6g、氯化钠(NaCl)6g、硝酸钠(NaNO3) lg、磷酸氢二钾(K2HPO4.3H20) llg，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用IM NaOH调pH值为8.2，补足蒸馏水至966mL，于121°C高压灭菌30min，待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清12mL，加入注射用50%葡萄糖22mL，混匀即为NKLB培养基，4°C _8°C保存。
[0055]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.39mg。
[0056]二、对比试验
[0057]1.以马丁肉汤作为培养基的对比试验
[0058]1.1对比试验中涉及的培养基为含3%小牛血清和0.25%葡萄糖的马丁肉汤和马丁琼脂平板，配制方法如下:
[0059]首先制作牛肉汤和猪胃消化液。
[0060]牛肉汤:除去脂肪、筋膜的牛肉500g，绞碎，加入1000mL蒸馏水，搅拌均匀。加热到65°C -70°C，保持45min，继续加热至煮沸，保持lh，其间不断搅拌。纱布过滤除去肉渣，加氯化钠5g,补充蒸懼水至1000mL, 116°C高压灭菌30min,|&存备用。
[0061]猪胃消化液:除去脂肪的猪胃300g，绞碎，加入56°C蒸馏水1000mL,再加入浓盐酸10mL，搅拌均匀，56°C水浴锅内水浴18h_24h，前12h至少搅拌10次。18h后观察，胃组织溶解，液体澄清即为消化完全，如果消化不完全，可适当延长消化时间。消化完全后，除去液面上的脂肪和浮沫，煮沸3min-5min，纱布过滤，加2N氢氧化钠溶液调pH值为6.0，补充蒸馏水至1000mL, 116°C高 压灭菌30min,|&存备用。
[0062]将牛肉汤和猪胃消化液等比例混合，以2N氢氧化钠溶液调pH值为7.6-7.8，121°C高压灭菌20min，即为马丁肉汤。待其自然冷却至室温，在无菌条件下，965mL马丁肉汤加入小牛血清30mL，加入注射用50 %葡萄糖5mL，混匀即为含3 %小牛血清和0.25 %葡萄糖的马丁肉汤。
[0063]将牛肉汤和猪胃消化液等比例混合，以2N氢氧化钠溶液调pH值为7.6-7.8，按1.5% (质量体积比)加入琼脂粉，121°C高压灭菌20min，冷却至60°C左右分装至平板，自然凝固后即为马丁琼脂平板。
[0064]1.2对比试验中涉及的菌种为禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株，购自国家兽医微生物菌种保藏中心。
[0065]1.3对比试验中涉及的种子液制备方法:将菌种冻干粉划线接种马丁琼脂平板，37°C温箱中培养20h。挑取马丁琼脂平板上圆形突起、表面光滑湿润、露珠样的单个菌落，接种于20mL的含3%小牛血清和0.25%葡萄糖的马丁肉汤，37°C温箱中培养20h后取出作为种子液。
[0066]对比试验1:
[0067](I)接种:
[0068]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)。
[0069](2)静置培养:
[0070]将步骤⑴中接种后的三角瓶置于恒温箱中，培养温度为37°C，培养时间为14h。[0071]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.16mg。
[0072]对比试验2:
[0073](I)接种:
[0074]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)；
[0075](2)振荡培养:
[0076]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为14h ；
[0077]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.34mg。
[0078]对比试验3:
[0079](I)接种:
[0080]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)。
[0081](2)振荡培养:
[0082]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为6h。
[0083](3)静置培养
[0084]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为37°C，静置培养时间为8h。
[0085]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.45mg。
[0086]结果比较:
[0087] 对比试验3的培养方法提取的荚膜量，分别比对比试验I (静置培养)的方法提高了 181.3% ;比对比试验2 (振荡培养)的方法提高了 32.4%。
[0088]2.以NKLB培养基作为培养基的对比试验
[0089]2.1称取胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠(NaCl) 5g、硝酸钠(NaNO3)0.85g、磷酸氢二钾(K2HPO4.3Η20) 9.13g，加蒸馏水800mL，摇匀溶解，用IM NaOH调pH值为7.8，补足蒸馏水至970mL，于121°C高压灭菌20min，待其自然冷却至室温，在无菌条件下，加入小牛血清10mL，加入注射用50%葡萄糖20mL，混匀即为NKLB培养基，4°C _8°C保存。
[0090]马丁琼脂平板的配制方法见以马丁肉汤作为培养基的对比试验。
[0091]2.2对比试验中涉及的菌种为禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株，购自国家兽医微生物菌种保藏中心。
[0092]2.3对比试验中涉及的种子液制备方法:将菌种冻干粉划线接种马丁琼脂平板，37°C温箱中培养20h。挑取马丁琼脂平板上圆形突起、表面光滑湿润、露珠样的单个菌落，接种于20mL的NKLB培养基，37°C温箱中培养20h后取出作为种子液。[0093]对比试验4:
[0094](I)接种:
[0095]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)。
[0096](2)静置培养:
[0097]将步骤⑴中接种后的三角瓶置于恒温箱中，培养温度为37°C，培养时间为14h。
[0098]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.15mg。
[0099]对比试验5:
[0100](I)接种:
[0101]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)。
[0102](2)振荡培养: [0103]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为14h。
[0104]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.32mg。
[0105]对比试验6:
[0106](I)接种:
[0107]将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的500mL三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的1% (4mL)，所述培养基的装量为三角瓶容积的4/5(400mL)。
[0108](2)振荡培养:
[0109]将步骤(1)中接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为37°C，摇床转速为200rpm，振荡培养时间为6h。
[0110](3)静置培养
[0111]将步骤(2)中振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为37°C，静置培养时间为8h。
[0112]提取培养液中细菌的荚膜，测定其中的蛋白质含量，计算得每mL培养基提取的荚膜量为0.42mg。
[0113]结果比较:
[0114]对比试验6的培养方法提取的荚膜量，分别比对比试验4 (静置培养)的方法提高了 180% ;比对比试验5 (振荡培养)的方法提高了 31.25%。
[0115]不同培养基不同培养方法提取的荚膜比较
[0116]
【权利要求】
1.一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，其特征在于，它包括以下步骤: (1)接种:将禽源多杀性巴氏杆菌接种于装有培养基的三角瓶中，所述禽源多杀性巴氏杆菌种子液的接种量为培养基总体积的0.5% -1.5%，所述培养基的装量为三角瓶容积的3/5-4/5 ； (2)振荡培养: 将经步骤(1)接种后的三角瓶置于恒温箱中振荡培养，培养温度为36°C-38°C，摇床转速为180rpm-220rpm，振荡培养时间为5.5h_6.5h ； (3)静置培养 将经步骤(2)振荡培养后的三角瓶置于恒温箱中静置，培养温度为36°C-38°C，静置培养时间为7.5h-8.5h。
2.根据权利要求1所述的一种提高禽源多杀性巴氏杆菌荚膜产量的培养方法，其特征在于:每升培养基中包含胰蛋白胨9g-llg,酵母粉4g-6g,氯化钠4g-6g,硝酸钠0.7g-lg,磷酸氢二钾7g-l lg，小牛血清8mL-12mL，50 %葡萄糖18mL-22mL ;所述培养基的pH为7.6_8.2 ο
【文档编号】C12N1/20GK103966143SQ201410214745
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】程龙飞, 林建生, 黄瑜, 傅光华, 施少华, 陈红梅, 万春和, 傅秋玲 申请人:福建省农业科学院