一种重组表达白血病抑制因子的方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组表达人源白血病抑制因子的方法，以及该方法中所用的核酸、载体、宿主细胞等。本发明的方法能够通过大肠杆菌重组表达制备具有高活力的白血病抑制因子的融合蛋白和成熟蛋白，活性蛋白表达量高于20毫克/升，并能用简单的纯化工艺分离纯化，因此生产成本低，更适合在实际使用中推广。
【专利说明】—种重组表达白血病抑制因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学及基因工程技术，具体地，涉及一种重组表达白血病抑制因子的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞(Stem Cells)是近年来国际和国内的一个研究热点。在干细胞维持和定向分化过程中需要一些价格高昂的细胞因子，例如维持干细胞的干性状态需要白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,缩写为 LIF)。
[0003]白血病抑制因子是一种多功能细胞因子，成熟的人源白血病抑制因子由180个氨基酸残基构成，含有三对二硫键，形成四螺旋束结构。由于白血病抑制因子的疏水性高，加之有3对二硫键，故而，重组表达非常困难。
【发明内容】
[0004]为了克服上述缺陷，本发明提供了一种重组表达白血病抑制因子的方法和其中所用的核酸、载体、宿主细胞等要素。
[0005]本发明提供了一种重组表达白血病抑制因子的方法，其特征在于:在白血病抑制因子的N-端融合荧光素酶。从而能提高白血病抑制因子在大肠杆菌中的溶解性，获得可溶性的表达产物。
[0006]在本发明中，重组白血病抑制因子相对于全长白血病抑制因子，N端被截短，尽管由于蛋白质表达后折叠过程一般是从N端开始的，N端的氨基酸序列对蛋白质构象及相应功能有较大影响，但是仍旧本发明的重组白血病抑制因子具有白血病抑制因子活性。
[0007]此外，该融合蛋白可以方便的加以纯化，获得的融合蛋白就具有白血病抑制因子的活性。
[0008]此外，该融合蛋白也可以进一步通过肠激酶酶切，去除荧光素酶标签，获得成熟的高活力的白血病抑制因子。
[0009]另外，本发明还提供了一种重组表达白血病抑制因子融合蛋白，其特征在于:由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成；或者由上述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组成。优选是取代、缺失或添加一个至五个氨基酸残基，更优选是取代、缺失或添加一个至三个氨基酸残基。
[0010]其中，在本发明中，通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、缺失或添加了氨基酸残基的多肽。
[0011] 上述用于取代的氨基酸残基为与原氨基酸残基侧链性质相似的氨基酸。其中，上述侧链性质相似的氨基酸可选自疏水性氨基酸(A、1、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、1、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。[0012]另外，将上述融合蛋白通过酶切，去除荧光酶素标签，获得的成熟白血病抑制因子蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示。
[0013]其中，通过常规技术，如PCR方法、重组技术或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得本发明的编码重组白血病抑制因子的核苷酸序列或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。
[0014]在本发明中，成熟白血病抑制因子蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0015]此处，值得指出的是，在本发明中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。
[0016]另外，在本发明中，“载体”是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。[0017]在本发明中，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。适用的载体包括但不限于:在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。
[0018]优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His, Leu, Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。最优选表达载体为大肠杆菌表达载体。
[0019]其中，根据本发明的方案，本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码重组白血病抑制因子的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的蛋白产物。
[0020]在本发明中，载体优选是原核表达载体，更优选是适于大肠杆菌表达的载体。最优选为包含有编码表达了如权利要求2的融合蛋白的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所
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[0021]另外，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码重组壳聚糖酶的核酸序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需蛋白产物。
[0022]在本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
[0023]其中，本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于:氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。
[0024]本发明的宿主细胞优选为细菌细胞；更优选是大肠杆菌细胞；最优选包含上述载体，或已为上述核酸转化或转染。[0025]此外，本发明还提供了制备上述重组白血病抑制因子的方法，包括，用上述宿主细胞表达该重组白血病抑制因子，并分离该重组白血病抑制因子。
[0026]具体地，该制备方法包括发酵步骤和分离纯化步骤。
[0027]其中，在发酵过程中，宿主细胞可以通过常规方法培养来表达所需要的蛋白产物，并使表达出的蛋白产物出现在在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质中或细胞外。
[0028]本发明优选通过诱导方式来表达重组白血病抑制因子。更优选通过IPTG诱导使转化的菌株表达该重组白血病抑制因子的。
[0029]对于分离纯化步骤，有大量分离纯化的方法可供选择:裂菌(如，超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(如，亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，或以上方法的组合。
[0030]在将表达菌体裂解后，通过金属螯合层析分离纯化重组白血病抑制因子，然后通过分子筛色谱去除杂蛋白，实现分离纯化的目的，因此简化了分离纯化步骤并降低了生产成本。因此，本发明优选分离纯化步骤中包括用金属螯合层析和分子筛色谱进行的分离纯化步骤。
[0031]本发明的作用和效果:
[0032]本发明通过基因工程手段，尤其是在大肠杆菌中以可溶形式重组表达荧光素酶融合的白血病抑制因子，以及从该融合蛋白通过酶切获得成熟白血病抑制因子的方法。 [0033]本发明通过基因工程手段高效表达，并能用简化的纯化工艺分离纯化，因此生产成本低，适合在实际使用中推广。
[0034]在本发明中，“具有白血病抑制因子活性”指的是能够与受体结合的能力。白血病抑制因子活性可以通过本领域已经存在的大量实验方法来测量。研究表明，本发明的重组白血病抑制因子的白血病抑制因子活性相对于全长白血病抑制因子的活性基本不减弱，活性蛋白表达量高于20毫克/升，其活性至多降低10-30%，根据具体方案的差异，部分活性为不减弱或活性有所提高的结果。
【专利附图】
【附图说明】:
[0035]图1:大肠杆菌诱导前、后，金属螯合层析纯化前、后白血病抑制因子样品用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定图谱；
[0036]其中，(M)蛋白标准品；⑶大肠杆菌诱导前；㈧大肠杆菌诱导后；⑶超声破胞后的上清；(P)超声破胞后的沉淀；(F)超声后的上清过Ni2+柱的穿透；(W) 30mM咪唑洗脱的蛋白；(E)250mM咪唑洗脱的蛋白。
[0037]图2:酶切后经过离子交换柱分离用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定图谱；
[0038]其中，(M)蛋白标准品；⑶酶切前的蛋白；㈧酶切后的蛋白；(F)上离子交换柱的穿透蛋白；(E)上离子交换柱通过NaCl梯度的洗脱蛋白；O LIF未加DTT处理；(+) LIF加20mM DTT 处理。
[0039]图3:融合蛋白6His-NanoLuc_LIF及成熟白血病抑制因子LIF与受体LIF-R饱和结合曲线图和竞争结合曲线图，在HEK293T细胞中瞬时过量表达受体LIF-R作为受体来源；
[0040]其中，(A)6His-NanoLuc_LIF饱和曲线；(B)LIF竞争结合曲线。
具体实施例
[0041]实施例1
[0042]荧光素酶和白血病抑制因子融合蛋白表达载体的构建
[0043]用pNLl.2 (Promega，Madison, WI，USA)作为模板，PCR进行扩增，引入酶切位点NdeI和EcoRI，pET载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH12S菌株(购自Invitrogen公司)。挑取数个转化的克隆抽提质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定的目的基因是否正确插入。选取有目的基因的质粒进行DNA序列测定，选取测序正确的DNA序列。得到N端带有6XHis-NanoLuc_tag 的 pNLuc。用 EcoRI and HindIII 进行酶切。
[0044]将两端带有EcoRI and HindIII酶切位点的的白血病抑制因子进行酶切，连接到预先用EcoRI and HindIII酶切的pNLuc上。连接产物转化大肠杆菌DH12S菌株(购自Invitrogen公司)。经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定后，将正确的白血病抑制因子表达载体命名为pNLuc/LIF。
[0045]实施例2
[0046]荧光素酶和 白血病抑制因子融合蛋白的诱导表达
[0047]用实施例1构建的pNLuc/LIF质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami2 (DE3)(Merck)，转化克隆生长在含有氨苄青霉素钠(lOOμg/ml)、氯霉素(25 μ g/ml)、盐酸四环素(lOμg/ml)的固体LB培养基上。挑取单克隆接种于50ml液体LB培养基中(含有100 μ g/ml氨苄青霉素钠、25 μ g/ml氯霉素、10 μ g/ml盐酸四环素)，于37°C震荡培养过夜(转速250rpm)。将20ml上述菌液接种于1000ml液体LB培养基中(含有100 μ g/ml氨苄青霉素钠、25 μ g/ml氯霉素、10 μ g/ml盐酸四环素)，于37°C震荡(转速250rpm)培养至菌液在600nm的吸光度约为1.0，然后加入IPTG至终浓度为lmmol/1。菌液于20°C继续震荡(转速150rpm)培养约18小时。根据SDS-PAGE鉴定结果。其中，液体LB培养基的配方为:称取胰化蛋白胨10克、酵母提取物5克、NaCllO克，加入蒸馏水I升，搅拌溶解，于121°C高温灭菌15分钟；固体LB培养基的配方为:每100毫升上述液体LB培养基中加入琼脂粉
1.5克，于121°C高温灭菌15分钟。
[0048]实施例3
[0049]荧光素酶和白血病抑制因子融合蛋白的分离纯化
[0050]将1000ml实施例2诱导表达的菌液离心(5000g，5min)，去上清，菌体用60ml裂解缓冲液(20mM Tris-Cl (pH8.5)，IOOmM NaCl)洗涤菌体。重悬菌液在冰上用超声波破碎(功率200W，超声5s，间歇3s，总超声时间为30min)。破碎菌液离心(12000g，30min)，取上清，其中含有重组白血病抑制因子。将上清过滤，上到用裂解缓冲液预平衡的金属螯合(Ni2+)层析柱上，流速lml/min。然后用含30mM咪唑的裂解缓冲液淋洗，最后用含250mM咪唑的裂解缓冲液洗脱白血病抑制因子，收集洗脱峰。根据SDS-PAGE鉴定结果，金属螯合层析回收的重组白血病抑制因子的回收率大于90%。
[0051]洗脱液上分子筛(TSKgelG2000SWXL, 7.8mmX300mm, from Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)，用 20mM Tris-Cl (pH8.5), 50mM NaCl 洗脱，根据 SDS-PAGE 鉴定结果。[0052]实施例4
[0053]从融合蛋白中酶切制备成熟白血病抑制因子
[0054]将实施例3 中的 6XHis-NanoLuc-LIF，WA 2.0mM CaCl2 和 1.6M 尿素，2ng/ml 肠激酶(New England Biolab, Ipswich, MA USA), 25°C过夜，进行酶切。
[0055]酶切后的溶液用20mM磷酸溶液(pH7.4)进行透析,透析后溶液上阴离子交换柱(TSKgel DEAE-5PW, 7.5mmX75mm，from Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)。穿透和洗脱峰通过SDS-PAGE鉴定。
[0056]实施例5
[0057]融合及成熟白血病抑制因子与受体结合活力测定
[0058]合成的LIF-R经PCR扩增，引入酶切位点NheI和AgeI，酶切后，连接到经过NheI和AgeI处理过的pcDNA6，选取有目的基因的质粒进行DNA序列测定，选取测序正确的DNA序列。将正确的受体命名为pcDNA6/LIFR。
[0059]将构建的pcDNA6/LIFR质粒使用脂质体2000转染HEK293T细胞，转染第二天，消化转染细胞，分到96孔板中，在5% CO2培养箱，37°C培养至90%的密度。
[0060]去除培养基，加入结合液(添加I % BSA,无血清DMEM培养基，100 μ I/孔)。饱和测定，测定溶液中含有不同浓度的6XNanoLuc-fuSed LIF0竞争测定，竞争溶液中含有
2.0nM6XHis-NanoLuc-LIF 和不同浓度的成熟型LIF。20-21°C孵育2h，去除测定溶液，冷的无血清DMEM培养基清洗两次(200 μ I/孔/次)。最后，用细胞裂解液(Promega)裂解细胞(100 μ I/孔)。细胞裂解产物50 μ I转移至白色不透明96孔板。添加用PBS按1:50稀释的底物(Promega), 50 μ I/孔,酶标仪(SpectroMax Μ5,美国分子仪器公司)即刻测突光读数。
[0061]SEQUENCE LISTING
[0062]〈110〉上海同科生物科技有限公司
[0063]〈120〉一种重组表达白血病抑制因子的方法
[0064]<130>2014
[0065]<160>4
[0066]<170>PatentIn version3.3
[0067]<210>1
[0068]<211>180
[0069]<212>PRT
[0070]〈213〉成熟蛋白
[0071]<400>1
[0072]
【权利要求】
1.一种重组表达白血病抑制因子的方法，其特征在于:在白血病抑制因子的N-端融合荧光素酶。
2.—种重组表达白血病抑制因子融合蛋白，其特征在于:由如Seq ID N0.2所示的氨基酸序列组成；或者 由所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组成； 所述取代的氨基酸残基为与原氨基酸残基侧链性质相似的氨基酸； 其中，所述侧链性质相似的氨基酸可选自疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、脂肪族侧链的氨基酸、含羟基侧链的氨基酸、含硫原子侧链的氨基酸、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸、含碱性基团侧链的氨基酸、含芳香族侧链的氨基酸。
3.如权利要求2所述的一种重组表达白血病抑制因子融合蛋白，其特征在于:能通过酶切，去除荧光酶素标签，获得一种成熟白血病抑制因子蛋白， 所述成熟白血病抑制因子蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示。
4.如权利要求2所述的一种重组表达白血病抑制因子融合蛋白，其特征在于:所述成熟白血病抑制因子蛋白的核苷酸序列如Seq ID N0.3所示。
5.—种载体,用于构建含编码重组表达白血病抑制因子的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因，其特征在于:为原核表达载体；所述原核表达载体为用于大肠杆菌表达的载体。
6.如权利要求5所述的一种载体，其特征在于:包含有编码表达了如权利要求2所述的融合蛋白的核酸，其核苷酸序列如Seq ID N0.4所示。
7.—种宿主细胞，其特征在于:包含如权利要求6所述的载体， 或已用如权利要求6所述的核酸转化或转染。
8.如权利要求7所述的一种宿主细胞，其特征在于:为大肠杆菌细胞。
9.一种制备重组白血病抑制因子的方法，其特征在于:包括发酵步骤和分离纯化步 骤， 其中，所述发酵步骤中，宿主细胞可以通过诱导方式来表达重组白血病抑制因子； 所述分离纯化步骤中，包括用金属螯合层析和分子筛色谱进行的分离纯化步骤。
10.如权利要求9所述的一种制备重组白血病抑制因子的方法，其特征在于:通过IPTG诱导使转化的菌株表达重组白血病抑制因子。
【文档编号】C12N15/62GK103981205SQ201410222283
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】施佳萍, 郭占云, 何胜祥 申请人:上海同科生物科技有限公司