一种jak2基因位点分型检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种JAK2基因位点分型检测试剂盒，其包括下列组件：1）PCR试剂：包括一对PCR正向引物SEQ?ID?NO:1和反向引物SEQ?ID?NO:2、双蒸水、Taq聚合酶，聚合酶缓冲液、dNTP与MgCl2；2）LDR试剂：包括荧光标记探针SEQ?ID?NO:3、一对检测探针SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5、双蒸水、Taq连接酶和连接酶缓冲液；3）标准品：野生型质粒DNA。本发明的检测试剂盒采用PCR关联LDR方法进行检测，具有结果可靠稳定、操作简单、快速的特点，简化了传统的PCR测序检测方法中，产物纯化和沉淀等繁琐步骤，减少检测时间，有较大的临床应用价值。
【专利说明】—种JAK2基因位点分型检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术检测领域,具体涉及一种Janus kinase 2 (JAK2)基因位点分型的检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]骨髓增殖性疾病(MPD)患者中JAK2基因(V617F)突变发生率非常高，约80%的真性红细胞增多症(PV)，以及50%的原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)患者含有该突变。JAK2基因发生V617F突变后，使JAK2蛋白持续磷酸化和活化，被认为增加了红细胞生成素的敏感性，以及不依赖红细胞生成素的髓系造血干细胞的存活，进而导致不受控制的细胞增殖。JAK2基因V617F突变检测是MPD可靠的鉴别诊断方法，能够将MPD与其它先天性或获得性红细胞增多症，原因不明的血小板增加，起源不明的骨髓纤维化等疾病区别开。
[0003]连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)是近年来发展的一种核酸检测技术，是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。该反应主要应用于单核苷酸检测领域，如单核苷酸多态性(SNP)检测(Clarissa Consolandi, Elena Busti, Cinzia Pera,et al., Detection of HLA Polymorphisms by Ligase Detection Reaction and a UniversalArray Format: A Pilot Study for Low Resolution Genotyping, Human Immunology, (2003)64: 168 - 178)。近几年，又出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术关联用于基因多态性位点检测(Norman P.Gerry et al., J.Mol.Biol.,(1999) 292: 251-262; U.S.Pat.Pub.N0.2003/0032016A1 )。同时，随着 LDR 技术的逐步成熟，相关LDR检测产品也在不断问世，如肿瘤化疗疗效及毒副作用检测的LDR方案，心脑血管疾病易感基因LDR检测等产品。在乙型肝炎病毒耐药突变中，所有相关的位点都是单碱基突变，为LDR技术的应用提供了可能。目前，已经有人成功报道了将乙型肝炎病毒中的YMDD和HDD用LDR技术在测序平台上进行了成功检测(Zhenxian X.，Junxua X., etal., A novel method based on ligase detection reaction for low abundant YIDD mutantsdetection in hepatitis B virus, Hepa to logy Research, (2006) 34: 150 - 155)。本专利在测序仪上实现用PCR-LDR技术检测JAK2基因位点，实现PCR-LDR技术在临床上的实验，同时也为实现PCR-LDR多基因位点检测打下基础。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的是提供一种PCR关联LDR测序检测技术的JAK2基因位点分型检测试剂盒。
[0005]为实现上述发明目的，本发明的检测试剂盒包括下列组件:
DPCR试剂:包括一对PCR正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2、双蒸水、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP与MgCl2 ；
其中，所用的一对PCR引物的序列如下所示:正向引物 SEQ ID NO:1:5’ -AGCAAGCTTTCTCACAAGCA-3’ ；
反向引物 SEQ ID NO:2:5’ -CTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’ ；
2)LDR试剂:包括荧光标记探针SEQID NO: 3、一对检测探针SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、双蒸水、Taq连接酶和连接酶缓冲液；
其中，突光标记探针和检测探针的序列分别为:
荧光标记探针SEQ ID NO:3:
5’ -TCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAATACCTACCTACCTACCTAC-3’ ；
检测探针SEQ ID NO:4:
5’ -CCTACCTACCTACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’ ；
检测探针SEQ ID NO:5:
5’ -TACCTACCTACCTACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’ ；
3)标准品:野生型质粒DNA。
[0006]采用上述检测试剂盒，可以实现一种新型的JAK2基因位点分型的检测方法，为实现多基因相关位点分型做好基础。
[0007]本发明检测JAK2基因位点的原理:
1.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
[0008]2、LDR技术原理:
LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。并通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。
[0009]JAK2检测序列: CTTAATTCTTTAGCAAGTGTTATTTAAAGGCTACATCCATCTACCTCAGTTTCCTATATCTATCTCTGACA
TCTACCTCTAGTTGTACTTCTGTCCTCTATTTCAGGTGTTATGGGTCAAGCCTGTTTGACTGGCATTATTCATGAT
TCCTGTACCACTCTTGCTCTCTCTCACTTTGATCTCCATATTCCAGGCTTACACAGGGGTTTCCTCAGAACGTTGA
TGGCAGTTGCAGGTCCATATAAAGGGACCAAAGCACATTGTATCCTCATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAA
GTGCATCTTTATTATGGCAGAGAGAATTTTCTGAACTATTTATGGACAACAGTCAAACAACAATTCTTTGTACTT
TTTTTTTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATT
ATGGAGTATGTg/rTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGAGCATCTGTTT
TTGTTTATATAGAAAATTCAGTTTCAGGATCACAGCTAGGTGTCAGTGTAAACTATAATTTAACAGGAGTTAAGTAT
TTTTGAAACTGAAAACACTGTAGGACTATTCAGTTATATCTTGTGAAAAAGGAAAGCAATGAAGTTAAAAGTAGAAG
GTTACAATGCCCAAACAATAGAGTATTATAGTAAACAAATGTCTATAAAACATTTTGTGTTCATGATAGCAAAAGAGATTATGGCAGGTTCA。
[0010]本发明提供的JAK2基因位点分型的检测方法具体包括下列步骤:
1)以基因组DNA为模板进行PCR扩增:所用的PCR引物为一对正向引物SEQID NO:1和反向引物SEQ ID N0:2，其PCR产物中含有检测相关位点；在病例中JAK2基因编码序列第1849个碱基序列由G突变为T，从而使该基因编码的第617位氨基酸由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F)，即JAK2基因V617F ；
正向引物 SEQ ID NO:1:5’ -AGCAAGCTTTCTCACAAGCA-3’ ；
反向引物 SEQ ID NO:2:5’ -CTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’ ；
2)对PCR的扩增产物进行LDR扩增:所用探针为相关位点的探针，其包括荧光标记探针 SEQ ID NO: 3 和一对检测探针 SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 5 ；
其中，突光标记探针和检测探针的序列分别为:
荧光标记探针SEQ ID NO: 3:
5’ -TCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAATACCTACCTACCTACCTAC-3’ ；
检测探针SEQ ID NO:4:
5’ -CCTACCTACCTACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’ ；
检测探针SEQ ID NO:5:
5’ -TACCTACCTACCTACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’ ；
3)用测序仪的Genescan功能对LDR产物进行分析，判断突变位点的基因型；
其中:步骤I)中所述基因组DNA的提取采用常规的血基因组抽提方法进行。
[0011]PCR 反应体系:双蒸水 9.1 μ L，IOX 聚合酶缓冲液 2 μ L，50mM MgCl2 2.4 μ L，IOmMdNTP 2 μ L, 2U/ μ L Taq 聚合酶 0.5 μ L，DNA 样本 2 μ L，弓丨物 2mM 2 μ L。
[0012]PCR反应程序:95°C 15分钟变性和酶激活；94°C 15秒变性；50-60°C 30秒至I分30秒退火；72°C 30秒至I分30秒延伸，循环35次；最后72°C 5分钟延伸，使反应产物扩增充分。
[0013]步骤2)中所述荧光标记探针的荧光基团为5-FAM、6-FAM、TAMRA, HEX、TET, JOE、VIC、NED、R0X、D1、D2、D3 或 D4。
[0014]步骤2)中所述LDR扩增所用的探针包括相关位点的探针，这些探针涉及两种探针:第一种探针是荧光标记探针，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度，同时进行3’荧光标记和5’端的磷酸化标记；第二种探针为检测探针，包含两部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度。其中第二种探针根据突变位点的需要进行设计，它可以为2-4根探针，探针中的3’端为检测位点。每组 相关位点的探针，针对核酸单碱基变化来设定检测探针的长度，以实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。
[0015]LDR所用荧光探针和检测探针的详细信息见表1。
[0016]表1 JAK2基因突变检测的LDR探针
【权利要求】
1.一种JAK2基因位点分型检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括下列组件:DPCR试剂:包括一对PCR正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2、双蒸水、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP与MgCl2 ； 其中，所用的一对PCR引物的序列如下所示:
正向引物 SEQ ID NO:1:5’ -AGCAAGCTTTCTCACAAGCA-3’ ；
反向引物 SEQ ID NO:2:5’ -CTGACACCTAGCTGTGATCCTG-3’ ； 2)LDR试剂:包括荧光标记探针SEQID NO: 3、一对检测探针SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、双蒸水、Taq连接酶和连接酶缓冲液； 其中，突光标记探针和检测探针的序列分别为: 荧光标记探针SEQ ID NO:3:
5’ -TCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAATACCTACCTACCTACCTAC-3’ ； 检测探针SEQ ID NO:4:
5’ -CCTACCTACCTACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTG-3’ ； 检测探针SEQ ID NO: 5:
5’ -TACCTACCTACC TACCTACCTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTT-3’ ； 3)标准品:野生型质粒DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK104004839SQ201410225328
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】祁小飞 申请人:苏州大学