黄瓜离体叶绿体电转化方法
【专利摘要】本发明涉及黄瓜离体叶绿体电转化方法。以黄瓜(Cucumis?sativum)无菌子叶分离的叶绿体为材料，建立了在适宜体积和叶绿体浓度与表达载体比例下的黄瓜离体叶绿体电转化体系。转化后叶绿体经短时孵育、离心、DNase?I消化后进行裂解，以提取的转化叶绿体DNA和RNA为模板进行PCR和RT-PCT鉴定，结果证明，叶绿体表达载体不仅能高效转入离体叶绿体中，而且在转录水平能检测到外源基因的表达。本发明克服了高等植物细胞内叶绿体转化周期长、技术难和成本高等难题，为高等植物叶绿体转化载体构建和关键元件的功能鉴定以及叶绿体基因表达调控和细胞工程等基础理论与应用研究提供了有效的新途径。
【专利说明】黄瓜离体叶绿体电转化方法
【【技术领域】】:
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，涉及以黄瓜为代表的高等植物离体叶绿体电转化、孵育及检测等方法。
【【背景技术】】:
[0002]叶绿体是母系遗传的植物特有细胞器，在细胞中不仅具有相对独立的环境，而且拷贝数很高，叶绿体遗传转化可实现外源基因的定点整合、以原核方式进行基因表达、利于同时转化多个基因和外源基因可稳定遗传等优点，是目前克服核转基因引发的基因逃逸、生态环境污染和食品安全恐慌等科学瓶颈问题的一种重要途径。
[0003]在高等植物细胞中有多拷贝，通常使用基因枪才能将外源表达载体打入细胞内的部分叶绿体中，若获得细胞内所有叶绿体共同转化状态，还需要在筛选压力逐渐淘汰未转化的叶绿体，经过多世代过程最终达到叶绿体同质化。由于叶绿体转化存在技术难、周期长、耗材与仪器昂贵 的问题，极大地限制了这项极具前途技术的研究与应用速度。
[0004]电转化虽然是一种普遍用于单细胞原核生物和真核生物核基因组转化的常用方法，但高等植物离体叶绿体电转化还没有查阅到可借鉴的成熟技术及文献。
【
【发明内容】
】:
[0005]本发明目的是解决现有组织和细胞水平叶绿体转化操作难、周期长和成功率低的问题，以黄瓜(Cucumis sativum)为材料,提供一种在无菌条件下的黄瓜离体叶绿体电转化、孵育与转化效果鉴定的成套操作方法与试剂配制体系。
[0006]本发明涉及完整叶绿体分离与转化前后处理、适宜条件与检测方法的一系列操作实现转化。离体叶绿体转化最大的优势是效率高和时间短，可以通过转化后瞬时转录物分析进行多种相关研究。此方法可普遍用于其他高等植物。
[0007]本发明提供的黄瓜(Cucumis sativum)离体叶绿体电转化、孵育和转化效果鉴定方法具体步骤包括:
[0008]第1、黄瓜离体叶绿体电转化与孵育:
[0009]第1.1、4°C和无菌条件下，将新鲜提取的黄瓜叶绿体进行离心(1000g/8~IOmin)，用0.3M~0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体沉淀后再次离心，重复这样的洗涤3~4次。
[0010]第1.2、最后用0.3M~0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体，并控制叶绿体悬液浓度为5 ~6X106/mL，冰浴。
[0011]第1.3、取150ul叶绿体溶液至1.5ml离心管中，加入约Iug转化质粒(叶绿体表达载体)，混匀后转入预冷的电转化杯中，以13kV/cm电压电击；电击后迅速向电转化杯中加入叶绿体孵育液，轻轻混匀后转移到1.5ml离心管中，以150rpm/min和25°C下避光孵育20分钟左右，转4°C避光过夜。
[0012]第2、黄瓜离体叶绿体电转化后PCR鉴定:[0013]第2.1、4°C下以1000g/8~IOmin离心收集经电转化和孵育的叶绿体，用Iml叶绿
体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤；
[0014]第2.2、取84ul孵育液重悬叶绿体，加入6ul DNaseI和IOul Buffer，25°C消化2h ;加入0.5M EDTA4ul至终浓度为20mM，65°C水浴20min，终止DNase I反应；
[0015]第2.3、4°C下1000g/8~IOmin离心收集叶绿体，用0.33M山梨醇洗叶绿体沉淀2~3次，取部分上清作为模板进行PCR，检测叶绿体外是否残留转化质粒；
[0016]第2.4、向叶绿体沉淀中加入400ul裂解液，65 V水浴20min ；加入200ul5MKAc(pH7.0)，冰浴 25 ~30min ;4°C下 12000rpm离心，取上清并加入 200ul Tris-酚和 200ul氯仿/异戊醇(24:1)，振荡后12000rpm离心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V无水乙醇，-20°C冰箱过夜沉淀核酸；次日12000rpm离心15min，弃上清。70%乙醇洗沉淀2次，37°C温箱烘干后用含RNase的ddH20溶解叶绿体DNA沉淀。
[0017]第2.5、以提取的叶绿体DNA为模板，依据第I步中叶绿体表达载体上的外源基因序列设计引物，以20 μ L总体系和35个循环进行PCR。
[0018]第3、黄瓜离体叶绿体电转化后RT-PCR鉴定:
[0019]第3.1、在4°C下，以1000g/8~IOmin离心收集经电转化和孵育的叶绿体，用Iml叶绿体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤；取150ul孵育液重悬叶绿体，加入等体积叶绿体裂解液混合均匀，65°C处理5min ;加入2M的KC140 μ 1，混合均匀后置于冰上 10-20min ；
[0020]第3.2、4°C下12000rpm离心10min,取上清于新管中，加入等体积苯酹/氯仿/异戍醇(25:24:1)混匀混匀，冰浴30min ;4°C下12000rpm离心10min,取上清于新管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)的混合液，冰浴30min ;4°C下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入1/3体积的8mol/L的LiCl，4°C过夜。
[0021]第3.3、4°C下12000rpml0min,弃上清，室温下干燥15min ;在冰上分别加入40 μ I DEPC-ddH20、4y 13mol/L NaAC (pH6.0),和 110 μ I 的无水乙醇，混匀后，_20°C 过夜。40C 12000rpml0min,弃上清，室温下干燥15min ;用DEPC_ddH20溶解RNA沉淀；
[0022]第3.4、取 71 μ I RNA 溶液，加入 0.5 μ I DNase 1-RNase free,8 μ I DNase Ibuffer和0.5μ I RNase抑制剂，37 °C水浴中温育40min ;向体系中加入120 μ I ddH20、100 μ I氯仿:异戊醇为24:1的混合液和100 μ I水饱和酹,混匀后在4°C下12000rpm下离心IOmin ;将离心后分层的液体中上层清夜取出至另一 EP管，加入1/10体积的3M NaAc和
2.5倍体积的无水乙醇，混匀后，在_20°C下静置超过4h ；
[0023]第3.5、在4°C和12000rpm下离心15min后弃去上清,加入1111170%乙醇轻轻清洗沉淀，然后在4?和12000rpm下离心10min ;弃上清,风干后溶解于20 μ I ddH20中。
[0024]第3.6、以上述第3.5步提取的叶绿体RNA为模板，使用大连宝生物(TAKARA)工程有限公司的反转录试剂盒cDNA Synthesis Kit (M-MLV version)反转录合成cDNA,再以该cDNA为模板、以转化载体上外源序列为引物用Taq酶进行PCR。为了检测经DNase I消化后RNA中是否残留了转化质粒DNA，以上述转化组叶绿体RNA为模板，以转化载体上外源序列为引物用Taq酶同时进行PCR，以此作为负对照。 [0025]其中，第I步所述的黄瓜离体叶绿体电转化后孵育液组成包括:
[0026]
【权利要求】
1.黄瓜离体叶绿体电转化方法，其特征在于该方法的具体步骤包括: 第1、黄瓜离体叶绿体电转化与孵育: 第1.l、4°c和无菌条件下,将新鲜提取的黄瓜叶绿体进行离心1000g/8~IOmin,用.0.3M~0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体沉淀后再次离心，重复这样的洗涤3~4次； 第1.2、最后用0.3M~0.33M山梨醇溶液重悬叶绿体，并控制叶绿体悬液浓度为5~.6XlOfVmLjKS ; 第1.3、取150ul叶绿体溶液至离心管中，加入Iug转化质粒即叶绿体表达载体，混匀后转入预冷的电转化杯中，以13kV/cm电压电击；电击后迅速向电转化杯中加入叶绿体孵育液，轻轻混匀后转移到离心管中，以150rpm/min和25°C下避光孵育20分钟，转4°C避光过夜； 第2、黄瓜离体叶绿体电转化后PCR鉴定: 第2.1、4°C下以1000g/8~IOmin离心收集经电转化和孵育的叶绿体,用Iml叶绿体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤； 第2.2、取84ul孵育液重悬叶绿体，加入6ul DNaseI和IOul Buffer，25°C消化2h ;加入0.5M EDTA4ul至终浓度为20mM，65°C水浴20min，终止DNase I反应； 第2.3、4°C下1000g/8~IOmin离心收集叶绿体,用0.3M~0.33M山梨醇洗叶绿体沉淀2~3次，取部分上清作为模板进行PCR，检测叶绿体外是否残留转化质粒； 第2.4、向叶绿体沉淀中加入400ul裂解液，65°C水浴20min ;加入200ul5M KAc，pH7.0，冰浴25~30min ;4°C下12000rpm离心，取上清并加入200ul Tris-酹和200ul氯仿/异戊醇为24:1的混合液，振荡后12000rpm离心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V无水乙醇，_20°C冰箱过夜沉淀核酸；次日12000rpm离心15min，弃上清；70%乙醇洗沉淀2次，.37°C温箱烘干后用含RNase的ddH20溶解叶绿体DNA沉淀； 第2.5、以提取的叶绿体DNA为模板，依据第I步中叶绿体表达载体上的外源基因序列设计引物，以20 μ L总体系和35个循环进行PCR ； 第3、黄瓜离体叶绿体电转化后RT-PCR鉴定: 第3.1、在4°C下，以1000g/8~IOmin离心收集经电转化和孵育的叶绿体，用Iml叶绿体孵育液重悬叶绿体，然后再离心，重复2次这样的洗涤；取150ul孵育液重悬叶绿体，加入等体积叶绿体裂解液混合均匀，65°C处理5min ;加入2M的KC140 μ 1，混合均匀后置于冰上.10_20min ； 第3.2、4°C下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇为25:24:1的混合液混匀，冰浴30min ;4°C下12000rpm离心10min,取上清于新管中，加入等体积氯仿:异戊醇为24:1的混合液，冰浴30min ;4°C下12000rpm离心10min，取上清于新管中，加入1/3体积的8mol/L的LiCl，4°C过夜； 第3.3、4°C下12000rpml0min，弃上清，室温下干燥15min ;在冰上分别加入40 μ IDEPC-ddH20、4y 13mol/L NaAC, pH6.0，和 110 μ I 的无水乙醇，混匀后，-20 °C 过夜；.4°C 12000rpml0min,弃上清，室温下干燥15min ;用DEPC_ddH20溶解RNA沉淀；
第 3.4、取 71 μ I RNA 溶液，加入 0.5 μ I DNase 1-RNase free>8 μ I DNase I buffer和0.5μ I RNase抑制剂，37°C水浴中温育40min ;向体系中加入120 μ I ddH20U00y I氯仿:异戍醇为24:1的混合液和100 μ I水饱和酹,混匀后在4°C下12000rpm下离心10min ；将离心后分层的液体中上层清夜取出至另一 EP管，加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后，在-20 0C下静置超过4h ； 第3.5、在4°C和12000rpm下离心15min后弃去上清，加入lml70%乙醇轻轻清洗沉淀，然后在4°C和12000rpm下离心10min ;弃上清,风干后溶解于20 μ I ddH20中； 第3.6、以上述第3.5步提取的叶绿体RNA为模板，使用大连宝生物工程有限公司的反转录试剂盒cDNA Synthesis Kit M-MLV version转录合成cDNA,再以该cDNA为模板、以转化载体上外源序列为引物用Taq酶进行PCR ;为了检测经DNase I消化后RNA中是否残留了转化质粒DNA，以转化组叶绿体RNA为模板，以转化载体上外源序列为引物用Taq酶进行PCR,以此作为负对照。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第I步所述的黄瓜离体叶绿体电转化后的孵育液组成包括:
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第2步和第3步所述的黄瓜离体叶绿体裂解液组成包括:
【文档编号】C12N15/82GK103966255SQ201410227461
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】白艳玲, 刘盛海, 路瑶, 王宏刚, 徐海津, 王勇, 张秀明, 乔明强 申请人:南开大学