一株水稻秸秆降解真菌拟康宁木霉zjc-1及其菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明属于废弃物资源利用技术，公开了一株水稻秸秆降解真菌及其菌剂。该菌株ZJC-1属于拟康宁木霉(Trichoderma?koningiopsis)，2014年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC?NO.8948；该菌株ZJC-1在CMC-刚果红培养基上可产生水解圈，可以在农业废弃物水稻秸秆为唯一碳源的培养基上生长。本发明还公开了一种含有水稻秸秆降解真菌ZJC-1的菌剂及其制备方法，本发明利用微生物发酵的方法降解水稻秸秆使其转化为有机肥料，可以变废为宝、保护环境，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一株水稻秸秆降解真菌拟康宁木霉ZJC-1及其菌剂
【技术领域】
[0001]本发明属于农业集约化生产技术，涉及一株水稻秸杆降解真菌及其菌剂，专用于降解废弃水稻秸杆生产有机肥料，实现有机废弃物资源化。
【背景技术】
[0002]我国是一个农业大国，如何处理农作物秸杆是大多数农区面临的一个难题，大量的废弃秸杆若不及时处理，不仅影响正常耕作，而且也成了病虫害繁殖的场所；如把其付之一炬，不仅严重污染环境，同时也浪费了秸杆中所含的有用资源和能源。农业废弃秸杆含有丰富的有机碳和大量的氮、磷、钾、硅等矿质营养元素，以及大量微量元素，是一种十分宝贵的农业资源。合理利用这种资源是农业可持续发展的一项重要任务。然而，秸杆中含有大量的木质素和纤维素，不易腐烂，不能就地进行还田处理，也不适用于造纸和作饲料。
[0003]大量的研究表明，秸杆还田能够有效增加土壤有机质含量，改良土壤，培肥地力，对于缓解中国土壤氮、磷、钾肥比例失调的矛盾具有十分重要的意义。但由于中国人口多耕地少，耕地复种指数高，倒茬时间短，加之秸杆碳氮比值高，给秸杆还田带来困难，且效果较差。因此通过秸杆处理将其制成有机肥，是一项能源环保双赢的技术。秸杆的资源化处理包括有物理法、化学法和生物法，而前两类方法处理成本高，且易造成二次污染，因此目前大多采用微生物处理法。微生物处理法就是把秸杆通过添加特定的秸杆分解菌剂，在田间常温的条件下，加速秸杆的腐解和转化。秸杆资源通过微生物分泌的细胞壁降解相关酶的分解成葡萄糖、木糖、纤维二糖、可溶性的寡糖，是大多数生物优先利用的碳源营养物质而被直接高效地转化利用。因此，利用纤维素分解菌剂建立新型的生物秸杆还田技术将成为解决大量秸杆资源的一条重要途径。
[0004]通过接种秸杆降解菌菌剂，加快底物中木质纤维类物质的分解，真菌产生的胞外纤维素分解酶活性远远高于细菌产生的纤维素分解酶活性。若能筛选到相应的高效功能菌株，将其用于废弃秸杆的降解和肥料生产，将会有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005]1.技术问题
[0006]本发明的目的在于提供一株能够高效分解农业废弃水稻秸杆的常温真菌拟康宁木霉，它能高效分解水稻秸杆，使得农田中的废弃水稻秸杆资源化，确保可持续农业的顺利发展。
[0007]2.技术方案
[0008] —株能降解水稻稻杆的真菌，该菌株ZJC-1属于拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis), 2014年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，菌种保藏号为CGMCC N0.8948。其生物学特征为，在PDA平板上培养I天后进入快速生长期，菌落中间有一圈明显的浅绿色产孢区，外观呈绒毛状；菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗主分枝长，次级分枝直角伸出，瓶梗基部缢缩，中间膨大，顶部变细；分生孢子短圆柱形，呈墨绿色。
[0009]本发明所述菌株ZJC-1在CMC-刚果红培养基上生长产生透明的水解圈。CMC-刚果红培养基配方为:羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 10g，(NH4)2S042g,KH2PO4Ig,MgSO4.7Η200.5g，刚果红0.2g,琼脂20g,去离子水1L, pH自然，121°C高压灭菌20min。
[0010]本发明所述菌株ZJC-1可以在水稻秸杆为唯一碳源的培养基上生长。
[0011]一种含有水稻秸杆降解真菌Zjc-1的菌剂，该菌剂中孢子浓度> 106cfu/mL.[0012]一种含有水稻秸杆降解真菌ZJC-1的菌剂的制备方法，包括以下步骤:将菌株Zjc-1接种至水稻秸杆粉培养基，20~25°C条件下静止培养6~8天，加入无菌水震荡，过滤除去培养物后得到孢子悬浮液，调整孢子悬浮液中孢子浓度> 106cfu/ml得到菌剂。
[0013]所述水稻秸杆粉培养基为:ΚΗ2Ρ43.0g, NaN0s3.0g, CaCl20.5g，MgSO4.7H200.5g，FeSO4.7H207.5mg, MnSO4.H202.5mg, ZnS042.0mg, CoC123.0mg,水稻秸杆粉末 IOg,琼脂 20g,去离子水1L, pH自然，121°C高压灭菌20min。
[0014]所述水稻秸杆粉末是粉碎后过40目筛、含水量I %以下的水稻秸杆粉末。
[0015]本发明所述菌株ZJC-1在降解水稻秸杆上的应用。
[0016]本发明所述含有水稻秸杆降解真菌ZJC-1的菌剂可用于降解农业废弃水稻秸杆。
[0017]试验表明，水稻秸杆接种孢子悬浮液(I %的孢子浓度106cfu/ml的孢子悬浮液)后，25°C条件下170r/min液体发酵培养7天和固体静止发酵14天，水稻秸杆的相对失重率分别为43.2%和37.1%。液体发酵完成后，过滤菌丝和固体杂质得到粗酶提取液，其滤纸酶活力(总纤维素酶活力)、纤维素内切酶活力及木聚糖酶活力分别为11.2、119.8和2238.4U/gds。粗酶提取液能水解低浓度碱处理的水稻秸杆，产生高浓度的还原糖(577.3mg/g 底物)ο
[0018]3.有益效果
[0019]水稻秸杆降解真菌ZJC-1可将废弃水稻秸杆发酵分解后制成有机物料，加速秸杆还田腐熟，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为菌株ZJC-1在以水稻秸杆为唯一碳源的水稻秸杆粉培养基上划线(A)以及在CMC-刚果红培养基上产生的水解圈(B)。
[0021]图2为菌株ZJC-1基于rDNA-1TS序列相似性的系统发育树。
[0022]图3为菌株ZJC-1粗酶提取液中滤纸酶活力。
[0023]图4为菌株ZJC-1粗酶提取液中纤维素内切酶活力。
[0024]图5为菌株ZJC-1粗酶提取液中木聚糖酶活力。
[0025]图6为水稻秸杆液体发酵前后对比效果图。
[0026]生物材料保藏信息
[0027]ZJC-1,分类命名为 Trichoderma koningiopsis,于 2014 年 3 月 24 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0.8948。
【具体实施方式】
[0028]实施例1[0029]I)高效秸杆降解菌株分离纯化:
[0030]称取IOg来自紫金山的腐败枝叶土壤，加入盛有90mL无菌水的500mL三角瓶中制成10%悬液，25°C、170r.mirT1条件下振荡培养ld，然后取IOmL悬液，将悬液稀释成10'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ-6的样品稀释液，选取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ-6四个稀释梯度，分别吸取100 μ L样品稀释液加入到稻杆粉培养基上，用灭菌涂布棒将培养基表面的样品稀释液轻轻涂抹均匀，每个浓度重复三次，做好标记。将涂布好的平板放置于25°C倒置培养3天后取出。将培养后平板上长出的单菌落继续通过稻杆粉平板进行分离纯化，直到获得纯菌株，涂布到CMC-刚果红平板25°C培养，观察在CMC-刚果红平板能否产生透明圈，挑选生长较快且可以产生透明圈的菌株进一步分离纯化，将它们接种至以水稻秸杆为唯一碳源的水稻秸杆粉培养基上培养，比较各菌株生长速度和生长情况，最终得到能高效降解水稻秸杆的真菌ZJC-1。该菌株ZJC-1可以在水稻秸杆为唯一碳源的水稻秸杆粉培养基上生长(图1A)，在CMC-刚果红培养基上可产生水解圈(图1B)。
[0031]水稻秸杆粉培养基为:ΚΗ2Ρ43.0g, NaN0s3.0g, CaCl20.5g，MgSO4.7H200.5g，FeSO4.7H207.5mg, MnSO4.H202.5mg, ZnS042.0mg, CoC123.0mg,水稻秸杆粉末 IOg,琼脂 20g,去离子水lL，pH自然，121°C高压灭菌20min。所述水稻秸杆粉末指的是粉碎后过40目筛、含水量I %以下的水稻秸杆粉末。
[0032]CMC-刚果红培养基为:羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 10g, (NH4) 2S042g, KH2PO4Ig,MgSO4.7Η200.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，去离子水1L，pH自然，121°C高压灭菌20min。
[0033]2)高效秸杆降解菌株鉴定:
[0034]真菌ZJC-1在 PDA平板上生长I天后，菌落中间有一圈明显的浅绿色产孢区，外观呈绒毛状；菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗主分枝长，次级分枝直角伸出，瓶梗基部缢缩，中间膨大，顶部变细；分生孢子短圆柱形，呈墨绿色。
[0035]采用真菌通用引物ITSl和ITS4进行PCR扩增，将PCR产物连接pMD_19T载体后测序，所得序列经 NCBI 比对，与 Trichoderma koningiopsis strain DMC795b 有 99% 的相似度。选取和它相近的一些菌株绘制系统发育进化树(图2)，以及结合菌落和菌丝形态学特征，鉴定该菌株为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)。
[0036]实施例2
[0037]将菌株ZJC-1接种至装有50mL水稻秸杆粉培养基的三角瓶中，25°C条件下静止培养7天，加30mL无菌水至三角瓶中，放在摇床上震荡30min，用纱布过滤培养物后得孢子悬液菌剂，使用生理盐水调整孢子悬浮液中孢子浓度为106cfu/mL，得到菌剂。
[0038]水稻秸杆粉培养基为:ΚΗ2Ρ43.0g, NaN0s3.0g, CaCl20.5g，MgSO4.7H200.5g，FeSO4.7H207.5mg, MnSO4.H202.5mg, ZnS042.0mg, CoC123.0mg,水稻秸杆粉末 IOg,琼脂 20g,去离子水lL，pH自然，121°C高压灭菌20min。所述水稻秸杆粉末指的是粉碎后过40目筛、含水量I %以下的水稻秸杆粉末。
[0039]实施例3
[0040]按照液体培养基体积的I %接种实施例2制得的菌剂至液体培养基中，在25°C、170r/min条件下培养7天，每天取适量发酵液，离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶提取液。每天测定粗酶提取液中滤纸酶(总纤维素酶)、纤维素内切酶及木聚糖酶活力。
[0041]液体培养基的配制:水稻秸杆粉末20g，(NH4)2SO4L 4g, KH2P042g, MgSO4.7Η200.3g，CaCl20.4g，胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η207.5mg, MnSO4.Η202.5mg, ZnS042.0mg, CoC123.0mg，去离子水水lL，pH自然，121°C高压灭菌20min。所述水稻秸杆粉末是粉碎后过40目筛、含水量I %以下的水稻稻杆粉末。
[0042]酶活的定义和测定:酶活性的测定参照国际标准方法。在相应的条件下，50°C下，Imin内催化底物水解生成I μ mo I生成物的酶量定义为一个酶活性单位(U), gds表示每克干重底物，采用DNS法测定酶解水稻秸杆产生的还原糖含量。
[0043]DNS试剂的配制方法:6.3g3, 5_ 二硝基水杨酸和21g NaOH,加到500mL含185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中一周后备用。
[0044]粗酶提取液能水解低浓度碱(0.042g/mL)处理的水稻秸杆，产生高浓度的还原糖(577.3mg/g底物)。同时从图3、图4、图5中看出，真菌ZJC-1能够产生大量的有关纤维素和半纤维素降解的酶类，滤纸酶活力(总纤维素酶活力)、纤维素内切酶活力及木聚糖酶活力最高值分别为11.2,119.8和2238.4U/gds，为其高效快速的降解水稻秸杆底物提供了基础。
[0045]实施例4
[0046]采用三角瓶液体发酵的方法研究真菌ZJC-1对水稻秸杆的降解效果。在500mL三角瓶装50°C烘干至恒重、剪碎至2-3cm长的水稻秸杆4g，液体培养基(同实施例3) 200mL,接种2mL实施例2制得的孢子浓度106cfu/mL的菌剂，混匀后置于25°C恒温170r/min培养。以接种等量无菌水作为空白对照。每处理三个重复。定期观察水稻秸杆的形态变化，7天后，洗去秸杆上的菌丝，烘干至恒重，测定其降解率。
[0047]接种菌剂后24小时液体培养基中开始出现白色菌丝，同时，水稻秸杆开始变软，崩解分散。至48小时已经长出大量的白色菌丝。空白对照处理中秸杆还是没有什么大的变化，依然完整，没有很明显的分解。结果表明，接种含有秸杆降解真菌ZJC-1菌剂的秸杆底物降解率为43.2%，空白对照底物的降解率为13.3%。
[0048]实施例5
[0049]水稻秸杆烘干至恒重，剪碎至2-3cm长，取IOg装入100目尼龙纱网袋，再分别加入30mL Mandels营养液和实施例2制得的孢子浓度106cfu/mL的菌剂12mL，将尼龙网袋置于5kg盆内，覆土 5cm，以接种等量无菌水做为空白对照，14天后洗去秸杆上的菌丝，烘干至恒重，测定其降解率。
[0050]Mandels 营养液的配制:(NH4)2SO4L 4g，ΚΗ2Ρ042.0g,尿素 0.3g，微量元素(MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.3g, FeSO4.7Η207.5mg, MnSO4.Η202.5mg, ZnS042.0mg, CoC123.0mg)，去离子水1L，121°C灭菌20min。
[0051]观察固体发酵结果可知，接种菌剂的处理中秸杆发黑变软，并呈现崩解分散。空白对照处理中秸杆较完整，没有明显分解情况。接种含有秸杆降解菌ZJC-1菌剂的秸杆固体发酵底物降解率为37.1%，空白对照固体发酵底物的降解率为12.4%。
[0052]通过实施例3、4和5可以看出接种降解菌ZJC-1可以显著加快秸杆的分解和其中成分的转化，加速底物的分解和转化。
【权利要求】
1.一株水稻稻杆降解真菌，该菌株Zjc-1属于拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis), 2014年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0.8948。
2.权利要求1所述的水稻秸杆降解真菌ZJC-1在水稻秸杆降解方面的应用。
3.一种含有权利要求1所述的水稻秸杆降解真菌ZJC-1的菌剂，其特征在于该菌剂中孢子浓度≥106cfu/ml。
4.权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤:将菌株ZJC-1接种至水稻秸杆粉培养基，20~25°C条件下静止培养6~8天，加入无菌水震荡，过滤除去培养物后得到孢子悬浮液，调整孢子悬浮液中孢子浓度> 106cfu/ml得到菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述水稻秸杆粉培养基为:ΚΗ2Ρ43.0g, NaN0s3.0g, CaCl20.5g, MgSO4.7Η200.5g, FeSO4.7Η207.5mg, MnSO4.Η202.5g,ZnS042.0mg, CoC123.0mg,水稻稻杆粉末IOg,琼脂20g,去离子水1L, pH自然，121°C高压灭菌 20min。
6.根据权利要求4或5所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述水稻秸杆粉末是粉碎后过40目筛、含水量1%以下的水稻秸杆粉末。
7.权利要求3所 述的含有水稻秸杆降解真菌ZJC-1的菌剂在降解水稻秸杆上的应用。
【文档编号】C12P19/00GK103992958SQ201410229566
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】徐阳春, 徐春淼, 韦中, 沈其荣 申请人:南京农业大学