一种牙周组织特异性细胞外基质ecm的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：1）人牙周膜细胞的分离与培养；2）牙周组织特异性ECM的制备；牙周组织特异性细胞外基质的应用，牙周组织特异性ECM作为体外扩增人牙周膜干细胞的应用；并促进其定向分化；具有制备方法简单、能显著促进牙周膜干细胞的体外增殖和定向分化的特点。
【专利说明】一种牙周组织特异性细胞外基质ECM的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及到一种牙周组织来源的细胞外基质的制备方法，以及其在牙周膜干细胞培养、扩增等方面的应用。
【背景技术】
[0002]牙周炎是人类最古老的、最普遍的疾病之一。它是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，可以导致牙周支持组织的炎症、牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最终造成牙齿松动以及被拔除。据统计，牙周炎患病率和严重性随年龄增高而增加，35岁以后患病率明显增高，50岁至60岁时达到高峰。目前，牙周炎在我国的患病率已超过80%,是我国成年人丧失牙齿的首位原因。同时，牙周炎还是全身系统性疾病例如糖尿病、心血管疾病的重要危险因素。
[0003]目前，对于牙周炎的治疗程序包括以下四个阶段:第一阶段，基础治疗，即运用洁治术、咬合调整、药物治疗等常规方法消除致病因素，控制炎症；第二阶段，牙周手术治疗，即通过翻瓣术、植骨术、引导组织再生术等清除感染组织，促进牙周再生；第三阶段，修复和/或正畸治疗，即在修复缺牙的同时固定松动牙，建立稳定的咬合；最后，牙周支持治疗，以使疗效得到长期保持。然而，现有的治疗方法都存在各自的局限性，尚不能实现理想的牙周再生和完全恢复牙周组织结构。
[0004]近年来，干细胞研究和再生医学的快速发展为治疗人类疑难疾病带来了曙光。Seo等首次从人牙周膜组织中分离出一种成体干细胞,命名为牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells, PDLSCs)(Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al.1nvestigationof multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.Lancet,2004，364:149-55.)。牙周膜干细胞被认为具备向成牙骨质细胞、成纤维细胞和成骨细胞分化的潜能，可以分别形成牙骨质、牙周韧带和牙槽骨，恢复复杂而精细的“三明治样”牙周组织结构，为牙周炎患者带来福音。然而，成体干细胞包括牙周膜干细胞在体外经过多次传代后，会逐渐丧失其干细胞的特性，发生自发分化或老化，而无法满足组织再生与重建的需求。因此，如何在体外大量扩增出高质量的牙周膜干细胞？如何精确控制牙周膜干细胞的定向分化？这些都是实现从实验室到临床应用成功转化中亟待解决的关键问题。
[0005]细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是指位于生物体内细胞外空间中、由细胞分泌的蛋白质和多糖所构成的网络结构总称。它或者以细胞外间质的形式充填于细胞与细胞之间构成细胞间黏合质，或位于结缔组织内构成其重要组成部分，或者以基底膜形式位于上皮与结缔组织交界区，对于细胞的附着、增殖和分化能够产生重要影响。同时，基质的物理性能也能够影响细胞的状态。Engler等研究发现基质的弹性模量能够指导间充质干细胞发生定向分化，例如类似于脑组织的软基质可诱导干细胞向神经细胞分化，类似于肌肉组织的基质可诱导干细胞向肌细胞分化，而类似于骨组织的硬基质则诱导干细胞向成骨细胞分化(Engler AJ, Sen S，Sweeney HL, et al.Matrix elasticity directsstem cell lineage specification.Cell, 2006,126:677-89)。Chen 等率先在国际上率先提出了“骨髓细胞(Bone marrow cells, BMCs)来源的ECM可以模拟体内微环境，保持间充质干细胞的干细胞特性”的假说，并进行了有效验证。他们将BMCs培养在普通培养板上，使BMCs分泌大量ECM，经有效的脱细胞处理后，剩下具有完整结构和蛋白组分的膜状ECM。他们首先研究了小鼠BMCs来源的ECM，与普通Plastic培养相比，该ECM可以促进小鼠BMMSCs增殖，同时保持细胞的骨向、脂向分化能力，体内移植实验结果显示在ECM上培养的小鼠BMMSCs生成的骨量和骨髓量分别比Plastic增加了 5倍和8倍(Chen XD, DusevichV, Feng JQ, et al.Extracellular matrix made by bone marrow cells facilitatesexpansion of marrow-derived mesenchymal progenitor cells and prevents theirdifferentiation into osteoblasts.J Bone Miner Res, 2007,22:1943-56)。他们进一步研究了人BMCs来源ECM对于hBMMSCs的作用，发现ECM能够促进细胞增殖，保持干细胞性，同时减少产生氧自由基的产生，提高端粒酶活性，增强对BMP2的成骨反应；体内实验结果表明，在ECM上扩增传代的hBMMSCs能够保持良好的成骨性能，而普通培养的细胞的成骨能力通常在 6~7 代后锐减(Lai Y, Sun Y, Skinner CM, et al.Reconstitutionof marrow-derived extracellular matrix ex vivo: a robust culture system forexpanding large-scale highly functional human mesenchymal stem cells.StemCells Dev, 2010, 19:1095-107) 0 ECM之所以能够发挥这样的作用其机理可能有两点:第一，ECM能够暂时“绑定”细胞分泌的内源性生长因子如BMP等，起到缓释效果，从而使细胞获得充足的增殖时间，并对外源性生长因子保持高度的敏感性；第二，扫描电镜显示ECM的结构如同有序排列的“轨道”，细胞在其上可以沿“轨道”迁移，就少发生“碰撞”，减少了接触抑制，从而促进了细胞 增殖，降低了分化的几率。
[0006]根据以上研究，我们推测“牙周膜来源的细胞外基质能够为牙周膜干细胞提供适宜的生长环境，促进其增殖及定向分化”。我们利用牙周膜细胞成功构建出牙周组织特异性ECM,并发现该ECM能够在体外高效扩增牙周膜干细胞，并且维持其较高的干性。迄今为止，未见到有关牙周组织特异性ECM的制备及其对牙周膜干细胞影响的报道。
【发明内容】
[0007]为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法及其用途，并利用这种组织特异性ECM在体外高质量扩增牙周膜干细胞并促进其定向分化，具有制备方法简单、能显著促进牙周膜干细胞的体外增殖和定向分化的特点。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，包括以下步骤:
I)人牙周膜细胞的分离与培养，具体做法是:
收集临床上12~29岁因正畸需要拔除的新鲜恒双尖牙和第三磨牙，牙周健康、无龋坏、无根尖炎症，在超净工作台中用75%的酒精消毒牙冠，PBS液漂洗3~5次，刮取根中1/3牙周膜,移入离心管,加入625units/ml的I型胶原酶和2.4units/mlDispase轻轻震荡,37°C培养箱内消化40min,每隔5min振荡I次,离心转速1200r/min,离心5min,弃去上清液；加入0.5~ImL含15%胎牛血清的α — MEM培养液，移入25mL培养瓶底壁，均匀接种，把培养瓶置入37°C、5%C02饱和湿度的孵箱中孵育24h，细胞贴壁后轻轻加入培养液至3mL ；3d后更换培养液弃去未贴壁细胞，以后每隔2~3d换液I次，收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用，细胞生长达80%~90%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化，以1:2比例传代；
2)牙周组织特异性ECM的制备，具体做法是:
将P3代人牙周膜细胞hPDLCs以2xl04cells/ml的密度接种于6孔板中，培养15天，每3-4天换液一次，最后8天换成膜诱导液，PBS液冲洗2遍，加入脱细胞处理液，室温下反应5分钟，PBS液冲洗3遍，获得hPDLCs-ECM，附着于6孔板，4° C低温保存。
[0009]所述的脱细胞处理液含有0.5%TritonX-100和20mM NH4OH的PBS液。
[0010]所述的PBS液含100U/ml青霉素，100μδ/πι1链霉素和两性霉素0.25Pg/ml。
[0011]所述的α — MEM培养液含15%胎牛血清，2mmol/L—谷胺酰胺，100U/ml青霉素及100μδ/πι1 链霉素。
[0012]所述的膜诱导液含有抗坏血酸50μΜ。
[0013]一种牙周组织特异性细胞外基质的应用，其特征在于，牙周组织特异性ECM作为体外扩增人牙周膜干细胞的应用，并促进其定向分化。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
I)本发明所制备的牙周组织特异性ECM可以高度模拟牙周组织微环境，显著促进牙周膜干细胞的体外增殖和定向分化，而无需在培养液中加入生长因子或对细胞进行基因修饰。
[0015]2)本发明所制备的牙周组织特异性ECM建立起了一个简单、有效的牙周膜干细胞生长的体外模型，有助于研究微环境对干细胞的影响，同时也有利于今后将牙周膜干细胞研究向临床应用的转化。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的显微镜下结果；其中，图1A为脱细胞处理前，4X ;图1B为脱细胞处理前，IOX ;图1C为脱细胞处理后,4X ;图1D为脱细胞处理后，IOX。
[0017]图2为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的扫描电镜下结果；其中，图2A为脱细胞处理前的图；图2B为脱细胞处理后的图。
[0018]图3为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的透射电镜下结果；其中，图3A为脱细胞处理前；图3B为脱细胞处理后。
[0019]图4为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的I型胶原免疫荧光染色；其中，图4A为脱细胞处理前；图4B为脱细胞处理后。
[0020]图5为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的Biglycan免疫荧光染色；其中，图5A为脱细胞处理前；图5B为脱细胞处理后。
[0021]图6为本发明牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的Decorin免疫荧光染色；其中，图6A为脱细胞处理前；图6B为脱细胞处理后。
[0022]图7为 牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)经脱细胞处理前后的Perlecan免疫荧光染色；其中，图7A为脱细胞处理前；图7B为脱细胞处理后。
[0023]图8为本发明牙周组织特异性ECMhPDLCs-ECM经脱细胞处理前后的Fibronectin免疫荧光染色；其中，图8A为脱细胞处理前的图；图8B为脱细胞处理后的图。
[0024]图9为本发明人牙周膜干细胞hTOLSCs在组织特异性ECM上生长状况的显微镜观察图。
[0025]图10为本发明人牙周膜干细胞hroLSCs在组织特异性ECM上培养后的生长曲线图。
[0026]图11为本发明人牙周膜干细胞hroLSCs在组织特异性ECM上的克隆形成检测及成骨成脂分化，大体观察图。
[0027]图12为本发明人牙周膜干细胞 hTOLSCs在组织特异性ECM上的克隆形成检测及成骨成脂分化，显微镜观察图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0029]本发明提供了一种简单、高效的牙周组织特异性ECM (hPDLCs-ECM)的制备方法，利用所制备的ECM可以在体外大量扩增人牙周膜干细胞hTOLSCs并促进其定向分化。
[0030]以人牙周膜组织特异性ECM的制备方法为例，具体步骤包括人牙周膜细胞的原代培养、传代培养、ECM的制备和检测，以及应用该ECM体外扩增人牙周膜干细胞hPDLSCs。
[0031]I)人牙周膜细胞hPDLCs的分离与培养，具体做法是:
收集临床上12~29岁因正畸需要拔除的新鲜恒双尖牙和第三磨牙，牙周健康、无龋坏、无根尖炎症，在超净工作台中用75%酒精消毒牙冠后PBS液漂洗3~5次，刮取根中1/3牙周膜，移入离心管，加入625units/ml的I型胶原酶和2.4 units/ml Dispase轻轻震荡，37°C培养箱内消化40 min,每隔5min振荡I次,离心机转速1200r/min,离心5min,弃去上清液。加入0.5~ImL含15%胎牛血清的α — MEM培养液，移入25mL培养瓶底壁，均匀接种.把培养瓶置人37°C、5%0)2饱和湿度的孵箱中孵育24 h，细胞贴壁后轻轻加入培养液至3mL。3d后更换培养液弃去未贴壁细胞，以后每隔2~3d换液I次，收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用，细胞生长达80%~90%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化，以
I:2比例传代。
[0032]2)牙周组织特异性ECM的制备
将P3代hroLCs以2x IO4 cells/ml的密度接种于6孔板中，培养15天，每3_4天换液，最后8天换成膜诱导液，PBS液冲洗2遍，加脱细胞处理液，室温下反应5分钟，PBS液冲洗3遍，获得hPDLCs-ECM，其附着于6孔板，4° C低温保存。
[0033]所述的脱细胞处理液含有0.5%TritonX-100和20mM NH4OH的PBS液。
[0034]所述的PBS液含100U/ml青霉素，100μδ/πι1链霉素和两性霉素(λ 25μδ/πι1。
[0035]所述的a —MEM培养液含15%胎牛血清，2mmol/L 一谷胺酰胺，100U/ml青霉素及100μδ/πι1 链霉素。
[0036]所述的膜诱导液含有抗坏血酸50μΜ。
[0037]牙周组织特异性ECM的结构观察
普通光学显微镜观察:去细胞处理前后在倒置显微镜下直接观察hPDLCs-ECM表面形态，如图1所示。[0038]扫描电镜(SEM)形态学观察hPDLCs-ECM:将hPDLCs-ECM用PBS洗涤三次，用含2%戊二醛的0.1M 二甲胂酸钠缓冲液(pH值7.2)固定I小时后，转移到的0.1M 二甲砷酸盐缓冲液中。标本经梯度浓度脱水(从70%到100%乙醇)后，喷金处理，标本使用场发射扫描电子显微镜(S-4800，Hitachi,日本)观察hBMCs_ECM超微结构。如图2所示。
[0039]透射电镜细胞超微结构观察:用2%戊二醛PBS固定液固定hPDLCs-ECM及hPDLCs
2h，收集沉淀物，经漂洗、固定、置换、浸透、包埋、切片，以枸橼酸铅电子染色，JEM — 1400透射电子显微镜(Philips，荷兰)观察细胞超微结构。如图3所示。
[0040]牙周组织特异性ECM的免疫荧光染色
将P3代hPDLCs和hPDLCs-ECM细胞爬片用PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛冰上固定20分钟，用 PBS漂洗 3 次，hPDLCs 细胞爬片加 0.5% Triton-100、1% BSA37°C封闭 20min，hPDLCs-ECM细胞爬片 1% BSA 37°C封闭 20min,加 COL 1、Biglycan、Decorin、Perlecan、Fibronectin一抗(1:500)，4°C过夜，次日复温后PBS洗3次。避光条件下分别加入FITC标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(1:200)，37°C孵育I小时，DAPI染色5min，PBS洗3次，封片，荧光显微镜观察，实验过程避光操作。阴性对照组以PBS代替一抗。如图4至图8所示。
[0041]人牙周膜干细胞hPDLSCs的分离培养
有限稀释法克隆培养纯化牙周膜干细胞:将上述收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清按1500 r/min离心10 min，经0.22 Mm直径的滤器过滤后，与培养基以1:1比例混合作为适应性培养基. 取对数生长期的第I代细胞用适应性培养基倍比稀释，调整细胞密度至10~15个/mL，吹打混匀，接种于96孔培养板中，100μΙ/孔，培养12 h后标记单个细胞贴壁的孔，并补液至200 μL/孔，5天后换液，光镜下观察克隆形成情况。常规培养7~14 d，至出现细胞克隆(细胞数≥50为判定标准)，待克隆长至孔底I / 3~I / 2后胰酶消化，转移至24孔板扩大培养。
[0042]牙周组织特异性ECM对于hTOLSCs增殖的作用
将P3代hPDLSCs以2x IO4 cells/ml的密度分别接种于普通培养板、hPDLCs-ECM培养板和hBMCs-ECM培养板，在接种后4小时、3天和7天分别观察细胞生长情况。如图9所示，hPDLSCs在hPDLCs-ECM培养板上的贴壁和生长优势明显。
[0043]取生长对数期的P3代hPDLSCs，接种于普通培养板、hPDLCs-ECM培养板和hBMCs-ECM培养板，七天后分别胰酶消化。细胞计数后，调整细胞密度为2X IO3/孔接种于96孔板，每孔加入液体lOOPL，共接种48个孔，培养过夜。次日更换培养液，待测孔加入100μL CCK8液，每次测量12个孔，孵箱培养4小时。4小时后酶联免疫检测仪450 nm出测量
12个孔吸光值去平均值。次日重复测量，连续测量7天，重复3次。如图10所示，hTOLSCs在hPDLCs-ECM培养板上培养过后增殖明显。
[0044]牙周组织特异性ECM对于hTOLSCs定向分化的作用
将P3代hPDLSCs低浓度(100 cells/well)分别接种于三组普通六孔板，、hPDLCs_ECM六孔板和hBMCs-ECM六孔板，常规α — MEM培养液(含15%胎牛血清，2 mmol/L 一谷胺酰胺，100 U/ml青霉素，100 Pg/ml链霉素)培养,每两天换液,培养14天后使用一组六孔板检测CFU-F克隆，即用PBS冲洗、甲醇固定、0.1%结晶紫染色IOmin ;另外两组六孔板继续培养，分别进行成骨诱导和成脂诱导(成骨诱导液为含15%FBS的α — MEM培养液，IOmmol/甘油磷酸钠，0.05mmol/L维生素C和100mmol/L地塞米松；成脂诱导液为含15%FBS的α—MEM培养液，1(^8/1111^胰岛素，ImmoL /L地塞米松,0.5 mmoL /L异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，200 μ moL /L吲哚美辛)，于20天后分别进行Von kossa染色和油红染色，检测CFU-OB和CFU-AD。如图11、12所示，hTOLSCs在hPDLCs-ECM上的克隆形成能力、成骨分化和成脂分化明显增强，其中成脂分化强于hBMCs-ECM组、成骨分化弱于该组，表明了牙周组织ECM的特异性作用。 [0045]本发明公开了一种牙周组织特异性ECM的制备方法，并应用该ECM对牙周膜干细胞进行体外扩增和定向分化。本发明所制备的牙周组织特异性ECM建立起了一个简单、有效的牙周膜干细胞生长的体外模型，有助于研究微环境对干细胞的影响，同时也有利于今后将牙周膜干细胞研究向临床应用转化。
【权利要求】
1.一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)人牙周膜细胞的分离与培养，具体做法是: 收集临床上12~29岁因正畸需要拔除的新鲜恒双尖牙和第三磨牙，牙周健康、无龋坏、无根尖炎症，在超净工作台中用75%的酒精消毒牙冠，PBS液漂洗3~5次，刮取根中1/3牙周膜,移入离心管,加入625units/ml的I型胶原酶和2.4units/mlDispase轻轻震荡,37°C培养箱内消化40min,每隔5min振荡I次,离心转速1200r/min,离心5min,弃去上清液；加入0.5~ImL含15%胎牛血清的α — MEM培养液，移入25mL培养瓶底壁，均匀接种，把培养瓶置入37°C、5%C02饱和湿度的孵箱中孵育24h，细胞贴壁后轻轻加入培养液至3mL ；3d后更换培养液 弃去未贴壁细胞，以后每隔2~3d换液I次，收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用，细胞生长达80%~90%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化，以1:2比例传代； 2)牙周组织特异性ECM的制备，具体做法是: 将P3代人牙周膜细胞hPDLCs以2xl04cells/ml的密度接种于6孔板中，培养15天，每3-4天换液一次，最后8天换成膜诱导液，PBS液冲洗2遍，加入脱细胞处理液，室温下反应5分钟，PBS液冲洗3遍，获得hPDLCs-ECM，附着于6孔板，4° C低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞处理液含有0.5%TritonX-100和20mM NH4OH的PBS液。
3.根据权利要求1所述的一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述的PBS液含100U/ml青霉素，100μδ/πι1链霉素和两性霉素0.25Pg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述的α — MEM培养液含15%胎牛血清，2mmol/L 一谷胺酰胺，100U/ml青霉素及lOOPg/ml链霉素。
5.根据权利要求1所述的一种牙周组织特异性细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述的膜诱导液含有抗坏血酸50μΜ。
6.一种牙周组织特异性细胞外基质的应用，其特征在于，牙周组织特异性ECM作为体外扩增人牙周膜干细胞的应用，并促进其定向分化。
【文档编号】C12N5/071GK103966158SQ201410230942
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】武俊杰, 孙薇, 丁寅, 陈晓东, 王阿娴, 唐丽 申请人:中国人民解放军第四军医大学