一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。该方法包括如下步骤：1)对待测苹果砧木和标准耐缺铁苹果砧木分别进行缺铁处理，提取总RNA；2)采用针对耐缺铁基因探针对总RNA进行斑点杂交；3)用ImageScannner扫描，并用ImageMaster分析，得到所述待测苹果砧木和所述标准耐缺铁苹果砧木中所述耐缺铁基因的表达量；4)若所述待测苹果砧木中所述耐缺铁基因的表达量不低于所述标准耐缺铁苹果砧木，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木。实验证明，本发明方法具有成本低廉和高效的优点，并且克服了耐缺铁苹果砧木常规选育的局限性，在基因水平上进行选育，为基因表达标记辅助选择育种奠定良好基础。
【专利说明】一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。
【背景技术】
[0002] 铁是植物生长发育的必需营养元素，在植物体的光合作用、呼吸作用、氮的固定、 蛋白质和核酸的合成等诸多生理代谢过程中发挥着极为重要的作用。全世界约有40%以 上的土壤缺铁，缺铁失绿症已成为植物营养失调的关键问题之一。为了适应缺铁胁迫，从土 壤中吸收更多的铁来满足自身生长发育的需求，高等植物在长期进化过程中逐渐形成了不 同的适应性机理。Romheld和Marschner在总结以前研究工一些作以及对120种来源不同 的植物缺铁反应机理的研究基础上，首先提出高等植物在适应缺铁胁迫过程中逐渐形成的 两种适应性机理，机理I和机理II。对这些机制的深入研究将为解决石灰性土壤上植物缺 铁问题提供重要的理论依据。机理I植物在缺铁胁迫的时候根系会发生一系列的形态变化 和生理生化反应。一些植物根毛密度增加，还有一些植物根表面会形成转移细胞。其主要 吸收机制是在缺铁时通过激活H +-ATPase，向根外释放更多的H+，使根际酸化，从而增加铁 的溶解性。同时会分泌一些有机酸与土壤中的三价铁螯合，以Fe 3+_螯合物的形式存在，此 时三价铁螯合还原酶催化电子从胞质中还原态的吡啶核苷酸（NADH)跨膜传递给胞外的螯 合物，将Fe 3+还原成Fe2+，然后Fe2+在质膜上二价铁转运蛋白的作用下由根表皮转运到细胞 内，这些因素共同作用，相互协调，使植物根系还原Fe3+的能力增强，显著提高了植物的吸 铁效率。
[0003] 小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是中国农业大学园艺植物研究 所经过多年努力从40多个苹果属植物的种或生态型中筛选出的第一个苹果铁高效基因型 (Han Z H, Shen T, Korcak R F, Baligar V C (1994) Screening for iron-efficient species in the genus malus. Journal of Plant nutritionl7 (4) :579-592)。研究结果表明，在缺铁胁 迫时，小金海棠表现出典型的机制I型植物的缺铁适应性反应（韩振海，沈隽.果树的缺铁 失绿症一文献述评.园艺学报，1991，18 (4) :323-328)。
[0004] 我国苹果产地土壤多偏碱性，土壤的钙化导致可溶性铁含量降低，因而苹果是发 生缺铁黄化病普遍而严重的树种之一。缺铁黄化病对果树的产量、品质、树势及农业经济效 益均造成极大的损失，如何解决苹果的缺铁黄叶病就显得极为重要。在现行经济条件下还 难以通过大面积的土壤改良或施肥进行缺铁矫正。而选育耐缺铁的砧木成为解决铁营养失 调问题的根本途径。苹果多为多年生木本植物，基因高度杂合，遗传背景复杂，所以传统的 育种方法在果树上还很难应用。随着分子生物学技术的发展，从分子水平研究育种方法，筛 选耐缺铁植株，将会成为解决苹果缺铁失绿症的根本途径，可为今后的果树优良种质定向 改良、更快更稳定地获得我国果树需要的新品种、新种质打下良好基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的方法，命名为 Dot-blot-macroarray法，具体可包括如下步骤：
[0007] (1)对待测苹果砧木植株和标准耐缺铁苹果砧木植株分别进行缺铁处理后，提取 总 RNA ;
[0008] (2)采用针对耐缺铁基因的探针对步骤⑴所得的总RNA进行斑点杂交；
[0009] (3)采用软件ImageScannner对步骤（2)获得的杂交结果进行扫描，并用软件 ImageMaster进行分析，分别得到所述待测苹果砧木植株和所述标准耐缺铁苹果砧木植株 中所述耐缺铁基因的表达量；
[0010] (4)根据步骤（3)的结果，按照如下方法确定所述待测苹果砧木是否为耐缺铁苹 果砧木：若所述待测苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量在统计学上不低于（最好为 显著高于）所述标准耐缺铁苹果砧木植株中相应所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测苹 果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木；反之，则所述待测苹果砧木不为或候选不为耐缺铁苹 果砧木。
[0011] 在所述方法的步骤（1)中，所述缺铁处理可为用4μπι〇1 · Γ1的铁离子进行处理 (正常供铁浓度为40 μ mol · L-1)。
[0012] 在本发明的一个实施例中，所述缺铁处理具体为：将所述待测苹果砧木植株或所 述标准耐缺铁苹果砧木植株种植于经过如下处理的河沙基质中：向不含铁离子的河沙基质 中通过滴灌提供含有铁离子浓度为4 μ mol · Γ1的改良Hoagland' S营养液。
[0013] 进一步，所述缺铁处理的时间可为1天。
[0014] 在所述方法的步骤（1)中，所述提取总RNA可为采用CTAB法提取总RNA。
[0015] 在所述方法的步骤（2)中，所述耐缺铁基因可为如下5个基因中的至少1个： Mxlrtl基因、MxCSl基因、MxHA7基因、MxFITl基因和MxRD3基因；
[0016] 所述Mxlrtl基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述MxCSl基因的核苷酸序列 为序列表中序列4 ;所述MxHA7基因的核苷酸序列为序列表中序列1 ;所述MxFITl基因的核 苷酸序列为序列表中序列2 ;所述MxRD3基因的核苷酸序列为序列表中序列5。
[0017] 在实际的生产中，所述5个基因只需检测一个即可，但为了提高所得候选耐缺铁 苹果砧木的准确率，可以检测所述5个基因中任何2个基因或更多个基因的表达量，若所述 待测苹果砧木植株中所述任何2个基因或更多个基因的表达量均在统计学上不低于（最好 为显著高于）所述标准耐缺铁苹果砧木植株中相应所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测 苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木。
[0018] 进一步，针对所述5个基因的探针具体如下：
[0019] 针对所述MxHA7基因的探针为序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA 分子；
[0020] 针对所述MxFITl基因的探针为序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA 分子；
[0021] 针对所述Mxlrtl基因的探针为序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分 子；
[0022] 针对所述MxCSl基因的探针为序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA 分子；
[0023] 针对所述和MxRD3基因的探针为序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA 分子。
[0024] 在所述方法的步骤（2)中，所述"对步骤（1)所得的总RNA进行斑点杂交"，可为现 有的斑点杂交方法。在本发明中，具体按照如下步骤进行：
[0025] (al)用地高辛标记所述探针；
[0026] (a2)将所述总RNA变性后用转到尼龙膜上，于120°C烘烤干燥30min ;
[0027] (a3)将步骤（a2)处理后的尼龙膜在杂交仪中于50°C、8_15转/分钟预杂交1-2 小时；
[0028] (a4)采用步骤（al)经地高辛标记过的探针对步骤（a3)预杂交过的尼龙膜在杂交 仪中于55°C、8-15转/分钟杂交16h以上；
[0029] (a5)洗涤步骤（a4)处理后的尼龙膜，加入封闭剂，于20_25°C封闭30min。
[0030] (a6)加入地高辛抗体抗体，常温下反应30min ;
[0031] (a7)洗膜后，加入检测缓冲液，平衡3_5min ;
[0032] (a8)将尼龙膜转移到显色液中，避光静置显色；
[0033] (a9)显色后，用水（如双蒸水）洗膜5分钟以终止反应。
[0034] 在上述方法中，用于检测的所述标准耐缺铁苹果砧木植株和所述待测苹果砧木植 株均可为苗期植株。进一步，提取所述总RNA时的取样标本可为苗期植株的根部（具体如 根部幼嫩部分）。
[0035] 在上述方法中，所述标准耐缺铁苹果砧木具体可为小金海棠。
[0036] 在上述方法中，所述待测苹果砧木可为任何可作为苹果砧木的植物品种。
[0037] 在本发明的一个实施例中，所述待测苹果砧木具体为小金海棠和山定子的杂交F1 代群体。
[0038] 本发明的另一个目的是提供一种定量检测基因表达的方法。
[0039] 本发明所提供的定量检测基因表达的方法，具体可包括如下步骤：
[0040] (a)采用针对待测基因的探针对生物样品进行斑点杂交；
[0041] (b)采用软件ImageScannner对步骤（a)获得的杂交结果进行扫描，并用软件 ImageMaster进行定量分析。
[0042] 其中，（a)中所述生物样品为用于测定所述待测基因表达量的生物样品。
[0043] 在本发明中，以上所有的所述软件ImageMaster均具体可为软件Image Master2D Platinum。
[0044] 另外，用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针也属于本发明的保护范围。
[0045] 所述用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针，具体可为如下中的全部或部 分：
[0046] (al)序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子；
[0047] (a2)序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子；
[0048] (a3)序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子；
[0049] (a4)序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子；
[0050] (a5)序列表中序列5的第43-765位所不的单链DNA分子。
[0051] 在本发明中，以上所有的所述耐缺铁均为可耐受4μ mol吨―1以下（如4μ mol ·〇 的铁尚子。
[0052] 在本发明中，以上所有的所述耐缺铁苹果砧木均指经4μπι〇1 · Γ1的铁离子处理 1天后黄化指数不高于（在统计学上等于或显著低于）经过相同处理的小金海棠的苹果 石占木。所述黄化指数分级标准参照"Gonzalo M J, Dirlewanger Ε, Moreno M A，Gogorcena Y(2012)Genetic analysis of iron chlorosis tolerance in Prunus rootstocks.Tree Genetics&Genomes8 (5) : 943-955" 一文。
[0053] 本发明在斑点杂交的基础上对结果进行定量化，创建了一种用于定量检测基因表 达的新方法，并将其应用于鉴定耐缺铁苹果砧木。实验证明，本发明方法与传统的RT-QPCR 相比，具有如下优点：成本低廉，探针可以反复利用；高效，可以一次检查上千个样品。另 夕卜，本发明可以在苗期进行早期选择，大大缩短育种周期，提高育种效率，在辅助育种中可 行性非常高。本发明克服了耐缺铁苹果砧木常规选育的局限性，在基因水平上进行选育，为 基因表达标记辅助选择育种奠定良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0054] 图1为缺铁黄化分级图。A黄化0级；B黄化1级；C黄化2级；D黄化3级；E黄化 4级。
[0055] 图2为5个基因探针的PCR检测图。泳道1、3、5、7、9分别为地高辛标记的MxFITl、 MxHA7、MxCSl、MxRD3和Mxlrtl探针；泳道2、4、6、8、10为相应的未经地高辛标记的对照。
[0056] 图3为部分样品的Dot-blot-macroarray法检测5个基因表达量图。
【具体实施方式】
[0057] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang):为铁高效基因型，记载于 "Han Z H, Shen T, Korcak R F, Baligar V C (1994) Screening for iron-efficient species in the genus malus. Journal of Plant nutritionl7 (4) : 579-592"一文，公众可从中国农业大学获 得。
[0060] 山定子（Malus baccata Bokh.):为铁低效基因型，记载于"张柳霞，王忆，朱 斌.苹果属山定子柠檬酸合成酶基因（MbCSl)的克隆及表达分析.农业生物技术学 报，2012年09期"一文，公众可从中国农业大学获得。
[0061] 实施例1、采用Dot-blot-macroarray法鉴定耐缺铁苹果站木
[0062] 一、待测苹果砧木的获得及缺铁处理
[0063] 以铁高效基因型的20年生小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为母 本树，铁低效基因型山定子（Malus baccata Bokh.)为父本树，2009年花蕾期去雄授粉套 袋，2010年播种，共得到145个匕群体，2012扦插扩繁，每个株系选取生长一致的三棵扦插 苗，移栽于河沙基质栽培槽中。正常供铁时铁离子浓度为40 μ mol · Γ1，缺铁处理时铁离子 浓度为4 μ mol · L'具体而言，向经过去离子水完全冲洗，经检测不含铁离子的河沙基质 中通过滴灌提供改良Hoagland' s营养液，其中正常供铁时铁离子浓度为40μπι〇1 · Γ1，缺 铁处理时铁离子浓度为4 μ mol · Γ1。
[0064] 其中，改良Hoagland' s营养液的配方为：四水硝酸I丐945mg/L ;硝酸钾506mg/ L ;硝酸铵80mg/L ;磷酸二氢钾136mg/L ;硫酸镁493mg/L ;铁盐溶液2. 5ml/L ;微量元素液 5ml/L ;pH = 6. 0。微量元素液：碘化钾0· 83mg/L ;硼酸6. 2mg/L ;硫酸锰22. 3mg/L ;硫酸锌 8. 6mg/L ;钥酸钠0· 25mg/L ;硫酸铜0· 025mg/L ;氯化钴0· 025mg/L。铁盐溶液：七水硫酸亚 铁（正常供铁时：2. 78g ;缺铁处理时：0. 278g);乙二胺四乙酸二钠（EDTA. Na)0. 373g ;蒸馏 水 500ml ;pH = 5. 5。
[0065] 对145个匕群体的扦插苗（每个株系3棵苗）进行正常供铁两周后后，进行缺铁 处理。同时以同期的小金海棠 （Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)扦插苗和山定子作为 亲本对照。
[0066] 二、待测苹果砧木的缺铁黄化指数调查和黄化分级
[0067] 在步骤一中对145个匕群体的扦插苗、小金海棠和山定子进行缺铁处理后，观察 各株系的缺铁黄化情况，进而进行缺铁黄化指数调查和黄化分级。
[0068] 缺铁黄化情况参考本领域公认的Gonzalo等（参考文献：Gonzalo Μ J, Dirlewanger E, Moreno Μ?, Gogorcena Y(2012)Genetic analysis of iron chlorosis tolerance in Prunus rootstocks. Tree Genetics&Genomes8 (5) :943-955)的分级标准。将 黄化程度最低定〇级，最高定为4级：黄化0级，完全没有黄化；黄化1级，轻微黄化，叶尖黄 化，黄化不超过1/2 ;黄化2级，中度黄化，全叶片黄化，但不呈典型的缺铁黄化；黄化3级， 重度黄化，全叶黄化，典型的缺铁黄化，即脉间失绿；黄化4级，全叶失绿，呈黄化或白化症 状（见图1)。每个株系从生长点往下取10个叶片，按以下公式计算黄化指数：黄化指数= [(黄化级值X相应黄化级值叶片数V(总叶片数X4) X 100% ]。其中，各株系的黄化指 数均为3棵扦插苗的平均值。黄化指数越低说明植株的耐缺铁能力越强，以小金海棠作为 标准对照，黄化指数不高于（在统计学上等于或显著低于）小金海棠的株系判定为耐缺铁 株系。
[0069] 结果显示，在缺铁处理的第18天后开始出现黄化，第30天黄化分级明显，且不同 株系黄化指数存在显著差异。具体如表1所示。
[0070] 表1各株系在缺铁处理30天后的黄化指数统计以及5个基因第二天在根部的
[0071] Dot-blot-macroarray 法测定表达量
【权利要求】
1. 一种用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的方法，包括如下步骤： (1) 对待测苹果砧木植株和标准耐缺铁苹果砧木植株分别进行缺铁处理后，提取总 RNA ； (2) 采用针对耐缺铁基因的探针对步骤（1)所得的总RNA进行斑点杂交； (3) 采用软件ImageScannner对步骤⑵获得的杂交结果进行扫描，并用软件 ImageMaster进行分析，分别得到所述待测苹果砧木植株和所述标准耐缺铁苹果砧木植株 中所述耐缺铁基因的表达量； (4) 根据步骤（3)的结果，按照如下方法确定所述待测苹果砧木是否为耐缺铁苹果砧 木：若所述待测苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量不低于所述标准耐缺铁苹果砧木 植株中所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木；反之， 则所述待测苹果砧木不为或候选不为耐缺铁苹果砧木。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述缺铁处理为用 4 μ mol · L-1的铁离子进行处理。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述耐缺铁基因为如下5个基因中 的至少1个：Mxlrtl基因、MxCSl基因、MxHA7基因、MxFITl基因和MxRD3基因。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，针对所述MxHA7基因的探针 为序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子； 针对所述MxFITl基因的探针为序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子； 针对所述Mxlrtl基因的探针为序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子； 针对所述MxCSl基因的探针为序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子； 针对所述和MxRD3基因的探针为序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述标准耐缺铁苹果砧木为小 金海棠。
6. -种定量检测基因表达的方法，包括如下步骤： (a) 采用针对待测基因的探针对生物样品进行斑点杂交； (b) 采用软件ImageScannner对步骤（a)获得的杂交结果进行扫描，并用软件 ImageMaster进行定量分析。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述软件ImageMaster为软件 Image Master2D Platinum。
8. 用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针，为如下中的全部或部分： (al)序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子； (a2)序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子； (a3)序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子； (a4)序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子； (a5)序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
【文档编号】C12Q1/68GK104195223SQ201410230957
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】韩振海, 朱明涛, 张新忠, 王忆, 吴婷, 贾文锁, 许雪峰 申请人:中国农业大学