一种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐病菌的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种石榴干腐病菌的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高效、稳定可靠的检测石榴干腐病菌的分子检测方法。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物。可用于田间调查和植物产品的检测，对控制石榴干腐病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原物的检测提供了技术指导和理论支持。
【专利说明】-种用于检测石榴干腐病菌的引物及利用其检测石榴干腐 病菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测石榴干腐病菌的引物，以及利用所述引物检测石榴干腐 病菌的分子检测方法。
【背景技术】
[0002] 石榴干腐病菌（Coniellagranati)引起石榴果实干腐病。该病害在希腊，韩国，土 耳其等国均有报道，在我国多个省份也有发生，但对其病原物的鉴定存在较大分歧。该病害 按常规方法分离会产生很多杂菌，影响病原菌的准确分离，常规的病害诊断技术难以快速 准确鉴定该病原菌。随着分子生物学技术的发展，采用分子检测方法为该病害的诊断提供 了很好的检测手段。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种石榴干腐病菌的检测方法及其引物，利用 该引物及检测方法检测石榴干腐病菌，速度快，准确，灵敏度高，稳定可靠。
[0004] 本发明提供的技术方案是：
[0005] -种用于检测石榴干腐病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列 如S1所述，下游引物序列如S2所述，其中，
[0006] S1 为：AAGGACACAACCCCAGATAC
[0007] S2 为：ATAAACTACTACGCTCAGAG。
[0008] -种利用上述引物检测石榴干腐病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作 为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约 为450bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
[0009] 上述的检测石榴干腐病菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为：所述PCR反应 的扩增体系为：l〇XTaq buffer2. 5μ L、25mmol/L MgC122. 0μ L、2. 5mmol/L dNTP2. 0μ L、 10以111〇1/1正反向引物各1.(^1^5以1^&8&86〇.2以1^20叩/^0)嫩模板2以1^补水至总体 积 25 μ L。
[0010] 所述的检测石榴干腐病菌的方法，所述PCR反应的反应程序为：94°C、4min ;94°C、 30s, 52°C、30s, 72°C、30s, 35 个循环；72°C、10min，4°C保存。
[0011] 本发明还提供另一种检测石榴干腐病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA 作为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA， 引物为真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4,第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产 物，引物为所述的引物S1和S2,取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳检测，如果存在分 子量约为450bp的DNA条带，则证明所检样品中含有石榴干腐病菌。
[0012] 本发明具有以下有益效果：
[0013] 本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织 中的Coniella granati。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染 初期鉴定出病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制石榴干腐病的大面 积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供 了技术指导和理论依据。
[0014] 本发明对从GeneBank中得到Coniella granati和其他同属的rDNA-ITS序列进行 分析，设计了一对特异性引物，利用该引物对其他病原菌进行特异性扩增，发现只能从该属 中扩增得到一条450bp的条带，其他菌株均无扩增条带出现，表明该对引物具有属间特异 性。以真菌的rDNA-ITS序列设计特异性引物来进行病害的诊断和植物病原真菌的分子检 测已得到广泛应用。
[0015] 高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否快速检测技术直接应用在 植物产品的检验检疫中。在25 μ L的反应体系中，普通的PCR方法能检测到long的基因组 DNA。曾经报道套式PCR能把检测灵敏度提高10?1000倍，在本发明建立的体系中采用套 式PCR技术将检测基因组DNA的灵敏度提高到了 1000倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1根据GeneBank中所有Coniella granati和其他同属的rDNA-ITS序列进行分 析设计的一对特异性引物；
[0017] 图2特异性引物的验证，M :2000bp marker ;泳道1 :石榴干腐病菌；泳道2-22 :其 他菌株；泳道23 :阴性对照；
[0018] 图3常规PCR对石榴干腐病菌的灵敏度检测，M :2000bp marker ;泳道1-9 :模板浓 度分别为 l〇〇ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg，lfg ;泳道 10 :阴性对照；
[0019] 图4套式PCR对石榴干腐病菌的灵敏度检测，M :2000bp marker ;泳道1-9 :模板浓 度分别为 l〇〇ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg，lfg ;泳道 10 :阴性对照；
[0020] 图5发病植株中石榴干腐病菌的PCR检测，M :2000bp marker ;泳道1 :以分离病菌 提取DNA为模板的PCR产物；泳道2-5 :以发病植株粗提取DNA为模板的PCR扩增产物；泳 道6 :健康植株对照；泳道7 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅作示例说明。
[0022] 实施例1 :设计、合成引物并建立石榴干腐病菌的PCR反应体系
[0023] -、引物设计与合成
[0024] 特异性引物的设计：对GeneBank中Coniella granati和其他同属的rDNA-ITS序 列进行分析，设计了一对特异性引物，序列如下：
[0025] SI ：AAGGACACAACCCCAGATAC
[0026] S2 :ATAAACTACTACGCTCAGAG。设计的引物重新在GeneBank中BLAST分析验证其特 异性。
[0027] 同时还使用了一对植物病原真菌ITS通用引物ITS1和ITS4作为套式PCR的外引 物，序列如下：
[0028] ITS1 ：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
[0029] ITS4 ：TCCTCCGCTTATTGATATGC
[0030] 所有引物都委托上海生工合成部合成。
[0031] 二、建立常规PCR反应体系
[0032] 常规 PCR 扩增体系为：10XTaq buffer2. 5μ L、25mmol/LMgC122. 0μ L、2. 5mmol/L dNTP2. Ομ L、10ymol/L正反向引物各 1. Ομ L、5U/L TagaseO. 2μ L、20ng/y LDNA模板2μ L, 补水至总体积25 μ L，在PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为：94°C预变性4min ;94°C 变性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0033] 三、建立套式PCR反应体系
[0034] 为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以植物病原真菌通用引 物ITS1/ITS4为第一轮反应引物，反应体系如上述常规PCR体系。反应程序中退火温度为 58°C，其他参数同上述常规PCR反应程序。然后以特异性引物，以第一轮PCR产物为模板 进行第二轮PCR扩增，所用引物为权利要求1所述的特异性引物S1和S2。体系同上，退火 温度为55°C，其他参数不变。所有试剂均购于合肥志宏生物有限公司。取5yL扩增产物 于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为450bp的 DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
[0035] 实施例2 :制备DNA模板
[0036] 提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下：
[0037] 1、菌丝体的培养、收集及DNA提取
[0038] PDA培养基：琼脂粉20g，土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。将供试病菌转至 PDA培养基平板上，20°C黑暗培养5d后从菌落边缘切取10块2cmX 2cm菌落块，转至PDA液 体培养基，28°C振荡培养7天，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨成粉，-20°C保存备用。
[0039] 基因组DNA的提取依照分子克隆提供的CTAB法，具体操作如下：
[0040] 取少量菌丝粉，加入900 μ L2% CTAB提取液和90 μ L10% SDS，涡旋混匀，于60°C 水浴lh，期间每隔lOmin上下颠倒几次，常温条件下12000rpm离心lOmin ;取上清，加入等 体积酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1)，颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min;将上 清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，常温条件下12000rpm离心5min ; 上清转移至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20°C条件沉淀15min ;常温条件下 12000rpm离心5min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37°C条件下待乙醇挥发干；加适 量灭菌超纯水或者TE(pH8. 0)溶解沉淀（含20μ g/ml RNase)，37°C消解30min后电泳检 测，-20°C保存备用。
[0041] 2、发病植物组织DNA的提取
[0042] 将供试病菌转至PDA培养基平板上，28 °C黑暗培养5d后从菌落边缘切取2cm X 2cm 菌落块，创伤接种于石榴植株上。一段时间后切取发病组织提取基因组DNA，具体操作： 取一些发病的植株组织，每晕克组织加入10 μ L、0. 5mol/LNaOH，在研钵中充分研磨后 转移至1. 5ml的离心管中，12, OOOg离心5min，取5μ L上清液加入495μ L、0. lmmol/ LTris (PH8. 0)，混匀后取1 μ L直接用于PCR反应。
[0043] 实施例3 :检测引物的特异性和灵敏度
[0044] -、特异性检测本发明所用菌株及相关信息见表1。采用本发明所设计的特异性引 物对表1中所有的供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，仅能从Coniella granati菌株中特 异地扩增出一条450bp的条带，而其他供试菌株及空白对照均无扩增条带。表明该引物具 有种属特异性，可以将Coniella granati与其他种属区分开。
[0045] 表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
[0046]
【权利要求】
1. 一种用于检测石榴干腐病菌的引物，包括一对引物，其特征在于：其上游引物序列 如S1所述，下游引物序列如S2所述，其中， 51 为：AAGGACACAACCCCAGATAC 52 为：ATAAACTACTACGCTCAGAG。
2. -种利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特征在于：提取待测 样品的DNA作为模板，利用上述设计的的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检 测，如果存在分子量为450bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有石榴干腐病菌。
3. 根据权利要求2所述的利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其 特征在于：所述PCR反应的扩增体系为：10XTaq buffer 2. 5pL、25mmol/L MgC12 2· 〇μ?、 2. 5mmol/L dNTP 2. 〇PL、l〇Mmol/L 正反向引物各 1. 〇PL、5U/L Tagase 0· 2μ?、20 ng/^LDNA 模 板2μ?,补水至总体积25μ?。
4. 根据权利要求3所述的利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特 征在于：所述PCR反应的反应程序为：94°C、4min ; 94°C、30 s，52°C、30 s，72°C、30 s，35个 循环；72°C、10min，4°C 保存。
5. -种利用权利要求1所述的引物检测石榴干腐病菌的方法，其特征在于：提取待测 样品的DNA作为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测 样品的DNA，引物为真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4,第二轮PCR反应的模板为第一轮 PCR反应产物，引物为所述的引物S1和S2，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳检测， 如果存在分子量约为450bp的DNA条带，则证明所检样品中含有石榴干腐病菌。
【文档编号】C12Q1/04GK104059968SQ201410231881
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】陈雨, 杨雪, 张爱芳 申请人:安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所