一种基因突变和酶活性的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种基因突变的检测方法，步骤如下：（1）制备纳米金颗粒；（2）将得到的纳米金颗粒通过S-Au键自组装与巯基标记的DNA探针相连接，制得纳米金探针；之后将标记了纳米金颗粒的探针与靶DNA序列杂交，形成不对称dsDNA,在TaqDNA聚合酶作用下，使探针以靶序列为模板延伸为平末端双链DNA；（3）将FAM羧基荧光素标记的探针与相应的模板温育杂交形成FAM标记的双链DNA，将其与（2）中的平末端dsDNA用T4连接酶在室温下连接，冷冻离心，沉淀经洗涤、分离，检测并判断得到的FAM标记的连接产物。本发明的方法操作简便，能够快速、灵敏检测p53基因的点突变，此方法也可应用到酶活性的研究中。
【专利说明】一种基因突变和酶活性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种基因突变和酶活性的检测方法。
【背景技术】
[0002]纳米金由于具有特殊的光学、电学、声学、磁学等性质以及良好的生物亲和 效应，在催化、自组装、微电子、传感器、生物标记、核酸检测、药物控释等方面均表现
出很多潜在的应用价值。纳米金与生物大分子之间的相互作用已有大量的报道。
[0003]恶性肿瘤一直以来严重威胁着人类健康。随着分子生物学的快速发展，人们逐渐认识到肿瘤源于基因水平的改变和由此产生的细胞生长、分化失调。抑癌基因的失活和癌基因的激活是肿瘤发生过程中最主要的事件，导致了细胞无限制生长，最终发生癌变。许多癌基因和抑癌基因已被发现，其中P53基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。该基因及其产物是各种理化因素及病毒致癌因子等最常作用的分子靶位。它可引起人类的多种肿瘤，包括肺、大肠、食管、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肝、乳腺、骨等部位的恶性肿瘤。人类肿瘤的大多数P53基因突变属于点突变。
[0004]基因突变检测在生物医学研究中起着非常重要的作用，可以作为遗传性疾病、肿瘤等的早期临床检测指标，对疾病的及时发现和治疗具有重要的意义。自从上个世纪80年代以来，基因突变检测技术得到了快速发展，一系列新的检测方法层出不穷，其中各有优缺点。一般而言，传统的P53基因突变检测方法操作大都比较繁琐，需要使用昂贵的仪器，且难以检出单碱基突变。能否通过改进检测方法，利用简单的方法及仪器来对基因突变进行超灵敏检测，是函待解决的问题。纳米金的特殊性质给P53基因突变的检测提供了新的研究思路。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种快速、简便、灵敏检测基因突变的方法，该方法利用纳米金重力通过荧光信号来检测基因是否突变、相关聚合酶及连接酶的活性。
[0006]本发明提供的一种基因突变的检测方法，步骤如下:
(1)制备纳米金颗粒；
(2)制备纳米金标记的双链DNA:将得到的纳米金颗粒通过S-Au键自组装与巯基标记的DNA探针相连接，制得纳米金探针；之后将标记了纳米金颗粒的探针与靶DNA序列杂交，形成不对称dsDNA，在Taq DNA聚合酶作用下，使探针以靶序列为模板延伸为平末端双链DNA ；
(3)将FAM羧基荧光素标记的探针与相应的模板温育杂交形成FAM标记的双链DNA，将其与(2)中的平末端dsDNA用T4连接酶在室温下连接，冷冻离心，沉淀经洗涤、分离，检测并判断得到的FAM标记的连接产物:
a、当步骤(2)所述的靶序列为与巯基探针互补的基因片段时，步骤(3)得到的沉淀中有可检测的荧光信号；
b、当步骤(2)所述的靶序列为发生了单碱基突变的基因片段时，步骤(3)得到的沉淀中中无可检测的荧光信号；
C、当步骤(2)所述的靶序列为任意序列时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信号。
[0007]优选地,步骤(1)制备得到的纳米金颗粒的直径为56-70nm。大部分在70mm左右。
[0008]优选地,步骤(3)中所 述的离心条件为12000 r/min,4°C, 15 min。
[0009]优选地，当所述靶DNA为p53基因序列时，所述巯基标记的DNA探针的核苷酸序列为:HS- (CH2) 6- CTA GAG GCA TCG TAG。
[0010]本发明还提供一种酶失活的检测方法，步骤如下:
(O制备纳米金颗粒；
(2)制备纳米金标记的双链DNA:将得到的纳米金颗粒通过S-Au键自组装与巯基标记DNA探针相连接，制得纳米金探针；之后将标记了纳米金颗粒的探针与与其完全互补的靶DNA序列杂交，形成不对称dsDNA，在Taq DNA聚合酶作用下，使探针以靶序列为模板延伸为平末端双链DNA ；
(3)将FAM羧基荧光素标记的探针与相应的模板温育杂交形成FAM标记的双链DNA，将其与(2)中的平末端dsDNA用T4连接酶在室温下连接，冷冻离心，沉淀经洗涤、分离，检测并判断得到的FAM标记的连接产物:
a、当步骤(2)所述TaqDNA聚合酶失活时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信
号;
b、当步骤(3)所述T4DNA连接酶失活时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信号；
c、当步骤(2)所述Taq DNA聚合酶失活且步骤(3 )所述T4 DNA连接酶失活时，步骤(3 )得到的沉淀中中无可检测的荧光信号。
[0011]优选地,步骤(3)中所述的离心条件为12000 r/min,4°C, 15 min。
[0012]优选地，当所述靶DNA为p53基因序列时，所述巯基标记的DNA探针的核苷酸序列为:HS- (CH2) 6- CTA GAG GCA TCG TAG。
[0013]如果靶DNA没有突变，则能与金探针杂交并使之延伸，在连接酶的作用下与带荧光信号的双链DNA连接，整体上形成一个完整的有荧光信号的双链；如果靶序列存在单碱基突变或是任意序列的，则连接酶则不起任何作用，带荧光信号的双链不能连接到纳米金颗粒上，离心后沉淀中无可检测的信号。同时，若Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶其中一个失活，都不能得到所检测的荧光信号。
[0014]应用本发明的方法不仅可以检测p53基因点突变，同时，由于作用原理相同，本发明的方法可以检测其他基因片段，只需要设计与其相反的探针序列即可。应用上述步骤建立的检测方法，通过利用纳米金的重力来检测DNA及其酶活性，达到操作简便，快速、灵敏检测p53基因点突变的目的，此方法也可应用到酶活性的研究中。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:图1为本发明利用纳米金重力检测DNA及其酶活性的原理示意图；
图2为本发明利用纳米金重力检测DNA及其酶活性可行性验证的荧光显微镜图；
图3为本发明连接DNA后纳米金的紫外表征图；
图4为本发明利用纳米金重力来检测DNA及其酶活性的荧光光谱图；
图5为本发明中FAM标记的单链DNA与其模板杂交前后荧光变化图。
【具体实施方式】
[0016]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0017]实验过程中使用的水均为灭菌水，实验所用的试剂均为分析纯。
[0018]本发明所设计的DNA序列(5，- 3’ )如下:
巯基探针:HS- (CH2) 6- CTA GAG GCA TCG TAG ；
完全互补的靶DNA (即p53基因序列):P0广-CGT GAC TAC GAT GCC TCT AG ；
单个碱基错配 DNA:P0广-CGT GAA TAC GAT GCC TCT AG ；
随机序列 DNA:P0广-TGA CAT GCA ATC AGT CAT TC ；
信号检测 DNA:6，-FAM - CGA ATT CCA G ；
信号互补 DNA:CTG GAA TTCG。
[0019]本发明的检测基因突变和酶突变的步骤如下:1)柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒:
a)将ImL 1% (24.28 mM)的氯金酸溶液定容到10mL加热至沸腾，搅拌Imin ；
b)迅速加入0.01 g/mL的柠檬酸钠溶液2 mL，溶液立即变成蓝色，继续加热至溶液由蓝色变为酒红色；
c)再加入ImL新配置的0.0754%硼氢化钠,搅拌约5 min~10 min,得到纳米金颗粒(AuNP)，4°C避光储存。
[0020]2)制备纳米金标记的双链DNA:
a)将各种序歹IjDNA 1D 用 TE (Tris-EDTA 缓冲液:10 mM Tris-HCl, I mM EDTA, pH 8.0)分别溶解，制备为100 μ M母液；
b)将纳米金颗粒与巯基(-SH)标记的DNA探针按IOD DNA/ImL纳米金溶液的比例室温下温育24 h，制得纳米金探针；
c)将纳米金探针分别与完全互补的靶DNA、单碱基错配的DNA、任意序列DNA按分子拷贝数1:1混合，室温温育Ih后，加入0.5 μ L 5U/ μ L Taq DNA聚合酶，0.5 μ L 10 mM dNTPmix,2uL 1XTaq buffer使探针延以靶序列为模板延伸，形成平末端双链DNA ;延伸温度和时间为:95°C 3min后冷却到37 V 1min。
[0021]d)连接信号分子:将FAM标记的荧光探针与其模板按分子拷贝数1:1室温下避光杂交2h，并比较杂交前后荧光信号的变化(通过测定无明显变化如图5)，加入5 U T4 DNA连接酶，2 μ L 50% PEG, 2 μ L 1X T4 buffer,按分子拷贝数1:1与C)中双链DNA连接；连接时间及温度为:22°C下避光反应lh。
[0022] e)将连接产物在高速冷冻离心机上12000 r/min, 4°C，离心15 min,分离沉淀和上清液，收集上清液，沉淀经磷酸缓冲液(PB)洗涤2~3次后溶解在TE缓冲液中，用荧光分光光度计和荧光显微镜分别测定。狭缝宽度为5 nm，激发波长Ex=492 nm，发射波长Em=518 nm。
[0023]如原理图1:
途径(I)所示，若靶序列DNA与探针完全互补，则能发生杂交、延伸、连接反应使FAM标记的荧光分子连接到纳米金上，由于纳米金的重力作用，通过离心，使荧光标记的双链DNA在沉淀中，而上清液中无可检测的荧光信号；
途径(2)、(3)所示，若靶序列发生单碱基错配或为任意序列，则不能发生杂交、延伸、连接反应使FAM标记的荧光分子连接到纳米金上，因此，离心后，沉淀中无可检测的荧光信号，而上清液中有突光信号。
[0024]图2用荧光显微镜图来验证实验方案的可行性，图中A、B、C分别代表靶序列为完全互补、单碱基错配及任意序列DNA，“ I ”代表沉淀，“ 2 ”代表上清液。对于靶序列为完全互补DNA，其荧光信号在沉淀中(Al)，上清液中则无明显荧光现象(A2);而单碱基错配及任意序列DNA对应的沉淀(B1、Cl)无明显荧光强度，而上清液(B2、C2)中有很强的荧光。荧光显微镜的结果与实验设计相符，表明设计方案的可行性。
[0025]从图3可以看出，离心后，沉淀中的产物为纳米金连接的DNA链，260nm左右的峰表示DNA的存在，530nm左 右的峰为纳米金颗粒的出峰位置，成功的证明纳米金颗粒与巯基标记的DNA相连接。
[0026]为了进一步确认沉淀是否是纳米金颗粒连接的带荧光信号的双链DNA，用荧光分光光度计来分别测定靶序列为完全互补(A)、单碱基错配(B)及任意序列DNA (C)相对应的沉淀“ I ”和上清液“ 2 ”，由图4可知其结果与荧光显微镜测定结果一致。
[0027]从图5可以看出，FAM标记的单链DNA (ssFAM)与其模板杂交后(dsFAM)荧光无明显变化，从而排除荧光检测时信号降低的干扰因素。
[0028]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种基因突变的检测方法，其特征在于:步骤如下: (O制备纳米金颗粒； (2)制备纳米金标记的双链DNA:将得到的纳米金颗粒通过S-Au键自组装与巯基标记的DNA探针相连接，制得纳米金探针；之后将标记了纳米金颗粒的探针与靶DNA序列杂交，形成不对称dsDNA，在Taq DNA聚合酶作用下，使探针以靶序列为模板延伸为平末端双链DNA ； (3)将FAM羧基荧光素标记的探针与相应的模板温育杂交形成FAM标记的双链DNA，将其与(2)中的平末端dsDNA用T4连接酶在室温下连接，冷冻离心，沉淀经洗涤、分离，检测并判断得到的FAM标 记的连接产物: a、当步骤(2)所述的靶序列为与巯基探针互补的基因片段时，步骤(3)得到的沉淀中有可检测的荧光信号； b、当步骤(2)所述的靶序列为发生了单碱基突变的基因片段时，步骤(3)得到的沉淀中中无可检测的荧光信号； C、当步骤(2)所述的靶序列为任意序列时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)制备得到的纳米金颗粒的直径为56_70nmo
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的离心条件为12000r/min, 4°C，15 min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:当所述靶DNA为p53基因序列时，所述巯基标记的DNA探针的核苷酸序列为:HS- (CH2)6- CTA GAG GCA TCG TAG。
5.一种酶失活的检测方法，其特征在于:步骤如下: (O制备纳米金颗粒； (2)制备纳米金标记的双链DNA:将得到的纳米金颗粒通过S-Au键自组装与巯基标记DNA探针相连接，制得纳米金探针；之后将标记了纳米金颗粒的探针与与其完全互补的靶DNA序列杂交，形成不对称dsDNA，在Taq DNA聚合酶作用下，使探针以靶序列为模板延伸为平末端双链DNA ； (3)将FAM羧基荧光素标记的探针与相应的模板温育杂交形成FAM标记的双链DNA，将其与(2)中的平末端dsDNA用T4连接酶在室温下连接，冷冻离心，沉淀经洗涤、分离，检测并判断得到的FAM标记的连接产物: a、当步骤(2)所述TaqDNA聚合酶失活时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信号; b、当步骤(3)所述T4DNA连接酶失活时，步骤(3)得到的沉淀中无可检测的荧光信号； c、当步骤(2)所述Taq DNA聚合酶失活且步骤(3 )所述T4 DNA连接酶失活时，步骤(3 )得到的沉淀中无可检测的荧光信号。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的离心条件为12000r/min, 4°C，15 min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:当所述靶DNA为p53基因序列时，所述巯基标记的DNA探针的核苷酸序列为:HS- (CH2)6- CTA GAG GCA TCG TAG。
【文档编号】C12Q1/68GK104031996SQ201410239372
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】卢小泉, 杜娇, 李毅然, 武国凡, 刘静, 袁彩霞, 陕多亮 申请人:西北师范大学