9号染色体上与水稻干尖线虫抗性qtl连锁的ssr标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记。本发明的实质是根据连锁分离规律，以水稻干尖线虫抗病品种Tetep和感病品种淮稻5号杂交后代F2群体为作图群体，通过水稻干尖线虫抗性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的SSR标记RM5526和RM3912。通过检测Tetep及其衍生品种(系)与水稻干尖线虫感病品种杂交组合后代单个水稻植株的SSR标记带型，可以判断该植株是否具有水稻干尖线虫抗性，将其应用于Tetep及其衍生品种(系)/感病品种水稻干尖线虫抗病品种的辅助选择育种中，可以克服常规育种中水稻干尖线虫抗性鉴定稳定性和、重复性差及费时费力等缺点，其结果可以简化选择方法和提高育种效率，进而加快抗水稻干尖线虫水稻病品种的选育进程。
【专利说明】9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的SSR标记及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及9号染色体上一种与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记RM5526和RM3912，可应用于分子标记辅助育种，属于水稻抗病育种和分子生物学领域。
【背景技术】:
[0002]水稻干尖线虫是一种水稻外寄生病原物，其典型症状是叶片尖部扭曲成干尖，该病害一旦发生会使粮食产量损失惨重(Journal ofthe faculty of Agriculture,Kyushu,University,1950,9(3):309-333 ;Nematologica,1975,21(3):351-357 ;Journal ofAgricultural Technology, 2011, 337-344)。水稻干尖线虫传统控制方法成本大，还会造成严重的环境问题(Journal of Agricultural Science and Technology, 2011,14(1):195-203)。利用水稻品种自身抗性是控制水稻干尖线虫最经济、环保、有效的策略(Annualreview of phytopathology,2001,39 (I):285-312 ;Plant resistance to parasiticnematodes,2002,141-151)。
[0003]育种家曾筛选到一些水稻干尖线虫抗性品种，如cvs Arkansas Fortuna,Nira43, Asa-Hi, Binam, Domsiah 等(Phytopathology, 1949, 39 ；Bulletin of the KyushuAgricultural Experiment Station, 1953,1 (3):339-349 ;Journal of AgriculturalScience and Technology, 2011,14 (I): 195-203)。但有些水稻干尖线虫抗性品种要么仅在特一地区表现抗性，要么仅对水稻干尖线虫表现抗性，对其他病原物高度敏感或仅有较低的产量(Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture, 2005,87-130)。另外，水稻干尖线虫种群的遗传变异会降低抗性品种的有效抗性，甚至造成品种抗性的消失。目前，水稻品种对水稻干尖线虫抗性的遗传基础及其分子机制也不清楚。阐明水稻对干尖线虫的抗性遗传基础及其分子机制有助于更深入的了解线虫与水稻的互作机制，为线虫抗性育种奠定基础(The Plant Journal2004, 38 (2):285-297)。另外，为寄主植物线虫抗性基因的鉴定和分离以及进一步在分子和生化水平上研究线虫与植物的互作机制提供了新的视野(The Plant Journal, 2002, 31 (2):127-136)。迄今，在甜菜、番茄、马铃薯、大豆等作物中定位到Hl、GroVl、Cre、Mi3等许多线虫抗性位点(Genome, 1993, 36 (I):152-156 ;Molecular Breeding,1996,2(I):51-60 !Theoretical and Applied Genetics,1994,89 (7-8):927-930 !Theoretical and Applied Genetics,1995,91 (3):457-464)。而且，已克隆到Hslpro-1、M1-1、HeroA和Gpa2等几个线虫抗性基因并对这些抗性基因进行了遗传和功能分析(Sciencel997, 275 (5301):832-834 ；Nature biotechnology, 1998,16(13):1365-1369 ；The Plant Journal,2002,31(2):127-136 ;The Plant Journal,2000,23(5):567-576)，这极大的增强了我们对这些寄主作物线虫抗性的分子机制的认识。然而，目前未见关于水稻品种对水稻干尖线虫抗性的数量性状位点(Quantitative TraitLocus, QTL)或基因的报道，对水稻干尖线虫的抗性研究仅在品种抗性鉴定水平上，这极大的限制了水稻干尖线虫抗性资源在抗性育种中的有效利用。[0004]分子标记辅助育种技术有效的解决了这一问题，通过构建重要抗源的遗传连锁图谱和QTL分析，可以有效的找到与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记，使用这些标记可以对该抗源的后代及其衍生品系在苗期进行早世代筛选，淘汰感病植株，不仅节约了成本，还提闻了育种效率。
【发明内容】
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[0005]本发明针对上述研究背景，以筛选到的水稻干尖线虫抗病品利Tetep和感病主栽品种淮稻5号为材料,在842对(http://www.gramene.0rg)微卫星标记中筛选到160个多态性SSR标记，从中选用127个SSR标记对淮稻5号/Tetep F2群体进行分析，构建水稻遗传连锁图谱，将其与F2:3家系的水稻干尖线虫人工接种鉴定后百粒线虫数(The number ofA.besseyi inlOOgrains, NA)之间进行连锁分析,获得了 9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的SSR标记RM5526和RM3912，可应用于水稻干尖线虫抗病品种的分子辅助选择育种。
[0006]本发明所提供的9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的SSR标记RM5526和RM3912，是通过以下方法获得的:
[0007]I)感病品种淮稻5号(早)与抗病品种Tet印(^ )杂交获得杂种F1, F1自交得F2群体，单株收获F2:3家系种子用于抗性鉴定；
[0008]2) CTAB法提取亲本、F1及F2群体138个单株的DNA ；
[0009]3)利用选出的127对SSR引物对亲本、F1及F2群体进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记数据，构建遗传连锁图；
[0010]4)亲本淮稻5号、Tetep及其杂交后代F1和F2:3家系进行水稻干尖线虫人工接利鉴定，种子成熟后单穗收种，统计NA ；
[0011]5)根据标记带型用MAPMAKER/EXP3.0软件计算出标记间连锁遗传距离，并用Mapdraw根据各标记在染色体上的位置画图，构建水稻遗传连锁图谱；
[0012]6)采用基于复合区间作图法的软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻干尖线虫的抗性QTL。LOD值的阈值定为2.5，按P = 0.05概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。
[0013]9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记RM5526和RM3912的应用包括:以Tetep及其衍生品种(系)与水稻干尖线虫感病品种杂交组合后代的单个水稻植株为对象，通过检测其9号染色体上RM5526和RM3912标记的带型数据，可以预测该植株对水稻干尖线虫的抗性。
[0014]本发明能克服常规育种中水稻干尖线虫抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，其结果可以简化选择方法和提高育种效率，进而加快抗病品种的育种进程。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1利用淮稻5号/Ter印F2群体构建的分子遗传连锁图谱
[0016]图2 9号染色体上水稻干尖线虫抗性QTL遗传连锁群定位分析示意图
[0017]注:抗性QTL连锁群区段；左侧为标记间遗传距离(CM);右侧为标记名称【具体实施方式】:
[0018]下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0019]实施例1，与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记的获得
[0020]1、植物材料
[0021]2008年在江苏省农科院大田种植淮稻5号和Tet印，并杂交获得杂种F1，次年F1自交得F2利子，2009年在海南繁殖F2群体，作为作图群体。F2单株编号，分蘖期取亲本、杂种F1及F2群体各单株的部分叶片，_70°C冰箱保存用于SSR分析，F2群体单株收种，以备表型鉴定。
[0022]2、线虫的培养与分离
[0023]将灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)菌块接种在 PDA (Potato Dextrose Agar)培养基上25°C培养,待灰葡萄孢菌长满培养基后,用3%双氧水对水稻干尖线虫表面消毒IOmin,灭菌超纯水洗涤3次后，将约400头水稻干尖线虫接种到长满培养基的灰葡萄孢菌上，于 25°C 培养 20d 左右(Journal of nematology, 2009,41 (I):17)。用 Baermann 漏斗技术分尚培养的水稻干尖线虫，并用3%双氧水表面消毒(Rice Science, 2009,16 (4):301-306)，无菌水冲洗后收集线虫，作为接种材料。
[0024]3、CTAB 法提取 DNA
[0025]I)称取500mg水稻叶片置于2.0mL Eppendorf管中，将离心管置于液氮中冷却，灌满液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末状；
[0026]2)65°C条件下水浴 1-1.5h，15min 震荡 I 次；
[0027]3)4°C条件下13，OOOrpm离心10min，取上层水相；
[0028]4)加入900 μ L氯仿:异戊醇溶液(24: I)，充分混匀震荡至溶液颜色由绿色变为白色；
[0029]5)4°C条件下13，OOOrpm离心10min，取上层水相；
[0030]6)加入等体积异丙醇，_20°C条件下静置20-30min，沉淀出絮状DNA ；
[0031]7)4°C条件下13，OOOrpm离心10min，弃上清，加入lmL70%乙醇洗涤，4°C条件下13, OOOrpm离心5min,弃上清,置于超净台上晾干。
[0032]8)加30 μ L去离子水溶解DNA，4°C保存备用。
[0033]用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测定OD值和浓度,将各样品DNA稀释至20ng/ μ L备用。
[0034]4、SSR标记分析
[0035](I) PCR 扩增
[0036]采用10 μ L 的 PCR 反应体系:DNA (IOng/ μ L) 1.3 μ L，Primer (4pmol/ μ L) 1.5 μ L，10 X PCR buffer (w/Mg) 1.5 μ L，dNTP (2.5mM) 0.2 μ L, Taq (5U/ μ L)0.1 μ L, ddH205.4 μ L。PCR反应程序:95°C变性5min ;95°C变性30s、54°C退火30s、72°C延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸lOmin。产物加入loading buffer中止反应，待用。
[0037](2)聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0038]采用8%聚丙烯酰胺凝胶检测上述PCR反应产物，所用的电泳仪为双板夹芯垂直电泳槽DYCZ-30型(北京六一仪器厂)。具体操作步骤如下:
[0039]I)用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗，烘箱烘干，组装玻璃板之前可用酒精擦拭。
[0040]2)将两块玻璃板放进橡胶封条内，琼脂糖凝胶封住底部安装至电泳槽上。
[0041]3)按表1顺序加入各储液配制丙烯酰胺凝胶，充分摇匀后用移液器将配好的胶均匀注入两玻璃板之间，再插入梳子，注意防止梳子底部产生气泡。静置Ih左右待其凝固。
[0042]表1制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积
[0043]
【权利要求】
1.一种与水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记,其特征在于:以水稻干尖线虫感病品种与抗病品种Tetep杂交后代F2群体为作图群体，通过简单重复序列标记(SSR)数据与水稻干尖线虫人工接种鉴定后百粒线虫数(NA)之间的连锁分析，获得9号染色体上与水稻干尖线虫抗性QTL(qNA9)连锁的SSR标记RM5526和RM3912。
2.按照权利I所获得一种与水稻干尖线虫感病品种/Tetep组合中水稻干尖线虫抗性QTL连锁的分子标记的应用，其特征在于:以Tet印及其衍生品种(系)与水稻干尖线虫感病品种杂交后代的单个水稻植株为对象，通过检测其分子标记RM5526和RM3912的带型数据，可以判断该植株是否抗水稻干尖线虫。
【文档编号】C12N15/11GK103981182SQ201410239722
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月25日 优先权日:2014年5月25日
【发明者】周彤, 杜琳琳, 周益军, 高存义, 兰莹, 孙枫 申请人:江苏省农业科学院