一种紫外切除修复蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种紫外切除修复蛋白的单克隆抗体及其应用，具体而言，涉及紫外切除修复蛋白(hHR23b)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体在预测HDAC抑制剂的临床治疗效果中的应用。
【专利说明】一种紫外切除修复蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种紫外切除修复蛋白（hHR23b)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体 的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。
【背景技术】
[0002] 组蛋白去乙酰化酶（HDAC，Histone deacetylase)是一个较新并且非常有潜力的 肿瘤治疗靶点。2006年，FDA批准了第一个HDAC抑制剂的新药Vorinostat，获得"突破性 药物"资格，用于治疗加重、持续和复发或用两种全身性药物治疗后无效的皮肤T细胞淋巴 瘤（CTCL，一种非霍奇金淋巴瘤）。以HDAC抑制剂为目标的新药研发进入一个新的台阶。 2013年，FDA给予恩替诺特（Entinostat) "突破性药物"认证，它与依西美坦联合，用于治 疗绝经后乳腺癌患者非留体芳香酶抑制剂（NSAIs)治疗后病情恶化，出现局部复发或雌激 素受体阳性的转移性乳腺癌，表明FDA对此类药物的重视。同年，Spectrum制药向FDA提 交新型广谱HDAC抑制剂Belinostat新药申请，用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤。
[0003] 虽然HDAC抑制剂抗肿瘤药物的研发如火如荼，但是相关药物的用药机理还不是 很清楚。因此治疗有效率较低，副作用也较大，因此主要用于治疗如皮肤T细胞淋巴瘤 (CTCL)这些小群体肿瘤。以Vorinostat治疗复发转移的皮肤T细胞淋巴瘤为例，它的治疗 有效率只有30% ;而Belinostat在129名接受治疗的复发或难治性外周T细胞淋巴瘤受 试者中，总应答率为26%。为了提高HDAC抑制剂的疗效，必须有能够有效预测药物应答效 率的检测方法出现，使得适合使用此类药物的病人及时得到医治，而不适合用药的病人不 会浪费必要的时间和金钱，实现个体化治疗的目的。
[0004] 2009年，牛津大学的Nicholas B. La Thangue教授，采用基因组范围内 Loss-of-Function筛选，发现了 hHR23b (紫外切除修复蛋白Rad23B)的表达能够影响各 种HDAC抑制剂诱导的细胞凋亡。次年，他们发表了进一步的研究，表明，hHR23b的表达是 Vorinostat治疗皮肤T细胞淋巴瘤的关键分子。在Vorinostat的二期临床样本中，hHR23b 高表达的病人，应答率为71.7%。而在hHR23b低表达的病人中，应答率只有41. 7%，具有 明显差别。同样在2012年发表的Belinostat治疗原发性肝癌的临床二期结果中，hHR23b 高表达的病人中，有58 %的病人有治疗效果。而hHR23b低表达的病人中，只有14%的病人 有疗效。这充分说明了 hHR23b很可能是一个通用肿瘤marker,它可能用于预测肿瘤病人对 于HDAC抑制剂的治疗效果，从而合理的指导临床用药。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种hHR23b单克隆抗体（anti_hHR23b)
[0006] 本发明所述的单克隆抗体anti_hHR23b是由保藏号为--的杂交瘤细胞株分泌， 所述的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，编号CGMCC No. 8883,保藏日期2014年5月7日，分 类名称为小鼠杂交瘤细胞株。
[0007] 本发明还涉及所述的单克隆抗体anti_hHR23b在检测靶蛋白hHR23b中的应用。
[0008] 本发明还涉及所述的单克隆抗体anti_hHR23b在预测HDAC抑制剂的临床治疗效 果中的应用，所述的应用包括但不限于，使用所述的单克隆抗体anti-hHR23b检测目标患 者肿瘤组织病理切片中hHR23b蛋白的表达量，高表达患者对HDAC抑制剂的治疗响应较好， 所述的HDAC抑制剂优选为Vorinostat。
[0009] 本发明还涉及所述的单克隆抗体及杂交瘤细胞在制备判断肿瘤患者的HDAC抑制 剂治疗响应性的试剂盒中的应用及由该方法制备获得的诊断试剂盒。所述的肿瘤包括但不 限于前列腺癌、表皮鳞癌、慢性粒细胞白血病、急性T细胞白血病、脑胶质瘤、宫颈癌、T细胞 淋巴瘤、原发性肝癌等。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1、SDS-PAGE分析纯化后的hHR23b单克隆抗体。
[0011] 图 2、免疫印迹法（Western blot)检测 hHR23b 在 A431，K562, Jurkat，C6,3T3 和 HeLa细胞中的表达。hHR23b单克隆抗体的稀释倍数为1 : 10000。
[0012] 图3、免疫荧光检测HeLa细胞中hHR23b蛋白的表达。
[0013] 图4、免疫组化检测前列腺癌组织中hHR23b蛋白的表达。
【具体实施方式】
[0014] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
[0015] 试剂、酶、载体及细胞株：
[0016] (1)、细胞株：HeLa( ATCC? CCL-2?)、A431 (CRL-1555?)、K562 (CCL-243?)、 Jurkat (TIB-152?)、C6 ( ATCC? CRL-2199?)、NIH/3T3 ( ATCC? CRL-1658?)和骨髓瘤细胞 SP2/0 ( ATCC? CRL-1581?);
[0017] (2)、实验动物：雌性BALB/c小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）；
[0018] (3)、酶及抗体试剂：构建载体过程和PCR过程的各种酶购自Fermentas，ELISA实 验所用抗体 anti-mouse IgG/HRP (Jackson ImmunoResearch)，ELISA 底物 TMB (Sigma)、逆转 录试剂盒（Fermentas)，BSA购自（北京元亨金马生物科技有限公司）
[0019] (5)、其他试剂如无特别说明为国产分析纯。
[0020] 实施例1 :杂交瘤细胞株5H1-A10-A7及其产生的单克隆抗体的获得。
[0021] (1)、动物免疫
[0022] 以重组人hHR23b蛋白为抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免 疫方法进行三次免疫注射。
[0023] 抗原蛋白的序列结构为：
[0024] MQVTLKTLQQQTFKIDIDPEETVKALKEKIESEKGKDAFPVAGQKLIYAGKILNDDTAL KEYKIDEKNF VVVMVTKPKAVSTPAPATTQQSAPASTTAVTSSTTTTVAQAPTPVPALAPTST PASITPASATAS SEPAPASAAKQ EKPAEKPAETPVATSPTATDSTS⑶SSRSNLFEDATSALVTG QSYENMVTEIMSMGYEREQVIAALRASFNNPDRAV EYLLMGIP ⑶ RESQAVVDPPQAASTGAPQSSAVAAAAATTTATTTTTSSGGHPLEFLRNQPQFQQMRQIIQQNPSLL PALLQQIGREN PQLLQQISQHQEHFIQMLNEPVQEAGGQGGGGGGGSGGIAEAGSGHMNYIQVTPQEKEAIE RLKA LGFPEGLVIQAYFACEKNENLAANFLLQQNFDED
[0025] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0. 2ml乳化液（lOOul纯化的 重组蛋白hHR23b (用1 X PBS稀释）+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原）。
[0026] 第二次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0. 2ml乳化液（lOOul纯 化的重组蛋白hHR23b (用1XPBS稀释）+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原）。
[0027] 第三次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液 (lOOul纯化的重组蛋白hHR23b (用1 X PBS稀释）+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原）。
[0028] 测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用常规的western法 检测效价，选择效价达到1 : 1〇〇〇的小鼠用于融合。
[0029] 加强免疫融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体 (含 60ug 抗原，溶剂为 lXPBS，pH7.4)。
[0030] (2)、细胞融合
[0031] 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平 皿中研磨，制备细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混 合（1 : 5-1 : 10)，并加入促融合剂聚乙二醇（50%)。采用HAT选择培养基，进行杂交瘤 细胞的选择性培养和筛选。
[0032] 用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：将抗原用包被液（pH9. 6、0. 05M碳酸盐缓 冲液）稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul /孔，放入4°C冰柜中包被过夜。弃去包被液， 用PBST(磷酸盐缓冲液，pH7. 4)洗板三次，加入封闭液3% BSA-PBST(加入3%牛血清白蛋 白的磷酸盐缓冲液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小时。弃去封闭液，PBST (磷酸盐缓冲液，pH7. 4) 洗板一次，甩干板子。将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板l〇〇ul/well，同时加入PBST (磷 酸盐缓冲液）作为阴性对照。37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀 释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板 三次，加底物TMBlOOul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul终止液（2mol/L硫酸）。 使用酶标仪测定，酶标仪设置为：450nm比色。和阴性对照相比，如果是0D值2.5倍之上就 是阳性。最后筛选得到一株效价最好的抗hHR23b的杂交瘤细胞株，命名为5H1-A10-A7,亚 型鉴定为IgG2b。
[0033] 将筛选出的阳性杂交瘤细胞株5H1-A10-A7进行单克隆筛选（有限稀释法），获得 能产生高效价（WB稀释比> 1 : 1000)单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株 扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人hHR23b杂交瘤细胞系5H1-A10-A7, 该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8883,保藏日期2014年5月7日，分类名称为小鼠杂交瘤细胞株。
[0034] (3)单克隆抗体的制备与纯化
[0035] 将步骤（2)获得的细胞株5H1-A10-A7接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从 腹水中纯化抗体（所获抗体命名为anti-hHR23b)。
[0036] 抗hHR23b单克隆抗体的纯化：使用Protein G亲和纯化法。将用PB溶液平衡好的 Protein G填料装入纯化柱中，加入经PB溶液稀释的单克隆抗体anti-hHR23b的腹水过柱。 上样结束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值< 0. 01。然后用0. 1M pH3. 0的甘氨酸-盐酸 溶液洗脱，收集整个洗脱峰的溶液。洗脱液经过透析浓缩并更换为PBS溶液。SDS-PAGE结 果显示，纯化后抗体纯度在95%以上（参见图1)，浓度0. 8mg/ml。
[0037] 实施例2 :单克隆抗体鉴定及应用
[0038] 1.小鼠抗hHR23b单克隆抗体（anti_hHR23b)的免疫印迹检测鉴定
[0039] 提取各种肿瘤细胞系的细胞裂解液，总蛋白浓度调整到2mg/ml，上样至12 %的 SDS-PAGE胶孔中，20ug/孔，电泳后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭后， 用实施例1制备得到的anti-hHR23b抗体进行免疫染色：加入实施例1步骤（3)制备并纯化 的anti-hHR23b，工作浓度为1 : 1000,4度孵育过夜，然后加入HRP标记的山羊抗鼠抗体， 工作浓度1 : 20000,于37度反应lhr，每个裂解液均出现55Kd的条带（参见图2)，与文献 报道相符，证明此抗体为抗hHR23b的特异性抗体；抗体稀释梯度达到1 : 1000(抗体工作 浓度能达到〇. 8ug/ml)有清晰条带，能够检测hHR23b在细胞中的表达。
[0040] 2.免疫荧光细胞染色鉴定
[0041] HeLa细胞用PBS洗两次，4%多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗，用0.5% Triton X-100PBS室温透化20min。然后加入5% BSA PBS以封闭非特异性反应。加入实施例1步 骤（3)制备并纯化的anti-hHR23b单克隆抗体1 : 100,37度孵育30min。冲洗，加入FITC 标记的山羊抗鼠 IgG，室温避光孵育lhr。去除游离的二抗，PBS冲洗，荧光封片剂封片，荧光 显微镜下观察，用蓝色光激发观察绿色荧光信号。实验结果（图3)清楚观察到细胞核中呈 现明显绿色荧光，细胞质有微弱表达，定位和文献报道一致。说明此抗hHR23b的特异抗体可 以用于免疫荧光检测观察hHR23b的表达和定位。
[0042] 3.免疫组化检测
[0043] 前列腺癌组织的石蜡切片经过脱蜡水化后，加入3% H202室温孵育5?10分钟，以 消除内源性过氧化物酶的活性。采用高压抗原修复方法进行抗原修复，溶液使用枸橼酸盐 缓冲液（PH6. 0)。经5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭后，加入anti-hHR23b单克隆抗体 1 : 100,37度孵育30min，PBS冲洗3次，加入HRP标记的山羊抗鼠 IgG，室温孵育lhr。PBS 冲洗5次，添加显色剂显色（DAB)。自来水充分冲洗，复染，封片。实验结果（图4)清楚观 察到细胞核中呈现明显染色，细胞质有微弱染色，定位和文献报道一致。说明此抗hHR23b的 特异抗体可以用于免疫组化检测观察hHR23b在组织中的表达和定位。
[0044] 最后，需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质， 不用于限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员能够根据一般技术知识和公知常识获 得的相关技术方案，都属于本发明要求保护的范围。
[0001] sequence list SEQUENCE LISTING <11〇>成都正能生物技术有限责任公司 邱俊康， 聂子梅， <120> 2014250014 〈130> -种紫外切除修复蛋白的单克隆抗体及其应用 <160> 1 <170> Patent In version 3.3 <210〉 1 <211> 409 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 1 Met Gin Val Thr Leu Lys Thr Leu Gin Gin Gin Thr Phe Lys Ile Asp 1 5 10 15 lie Asp Pro Glu Glu Thr Val Lys Ala Leu Lys Glu Lys lie Glu Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Lys Asp Ala Phe Pro Val Ala Gly Gin Lys Leu lie Tyr 35 40 45 Ala Gly Lys lie Leu Asn Asp Asp Thr Ala Leu Lys Glu Tyr Lys lie 50 55 60 Asp Glu Lys Asn Phe Val Val Val Met Val Thr Lys Pro Lys Ala Val 65 70 75 80 Ser Thr Pro Ala Pro Ala Thr Thr Gin Gin Ser Ala Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Thr Ala Val Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Val Ala Gin Ala Pro Thr 100 105 110 Pro Val Pro Ala Leu Ala Pro Thr Ser Thr Pro Ala Ser lie Thr Pro 115 120 125 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ala Ser Ala Ala Lys 130 135 140
[0002] sequence list Gin Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Glu Thr Pro Val Ala Thr Ser 145 150 155 160 Pro Thr Ala Thr Asp Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ser Arg Ser Asn Leu 165 170 175 Phe Glu Asp Ala Thr Ser Ala Leu Val Thr Gly Gin Ser Tyr Glu Asn 180 185 190 Met Val Thr Glu Ile Met Ser Met Gly Tyr Glu Arg Glu Gin Val lie 195 200 205 Ala Ala Leu Arg Ala Ser Phe Asn Asn Pro Asp Arg Ala Val Glu Tyr 210 215 220 Leu Leu Met Gly lie Pro Gly Asp Arg Glu Ser Gin Ala Val Val Asp 225 230 235 240 Pro Pro Gin Ala Ala Ser Thr Gly Ala Pro Gin Ser Ser Ala Val Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Gly 260 265 270 Gly His Pro Leu Glu Phe Leu Arg Asn Gin Pro Gin Phe Gin Gin Met 275 280 285 Arg Gin lie lie Gin Gin Asn Pro Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Gin 290 295 300 Gin lie Gly Arg Glu Asn Pro Gin Leu Leu Gin Gin lie Ser Gin His 305 310 315 320 Gin Glu His Phe lie Gin Met Leu Asn Glu Pro Val Gin Glu Ala Gly 325 330 335 Gly Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly lie Ala Glu Ala 340 345 350 Gly Ser Gly His Met Asn Tyr lie Gin Val Thr Pro Gin Glu Lys Glu 355 360 365 Ala lie Glu Arg Leu Lys Ala Leu Gly Phe Pro Glu Gly Leu Val lie 370 375 380 Gin Ala Tyr Phe Ala Cys Glu Lys Asn Glu Asn Leu Ala Ala Asn Phe 385 390 395 400
[0003] sequence list Leu Leu Gin Gin Asn Phe Asp Glu Asp 405
【权利要求】
1. 一种针对紫外切除修复蛋白（hHR23b)的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结 合hHR23b蛋白。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体由保藏号为CGMCC No. 8883 的杂交瘤细胞分泌。
3. 分泌如权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系 的保藏号为CGMCC No. 8883。
4. 权利要求1或2所述的单克隆抗体及权利要求3所述的杂交瘤细胞在检测靶蛋白 hHR23b中的应用。
5. 权利要求1或2所述的单克隆抗体及权利要求3所述的杂交瘤细胞在预测HDAC抑 制剂的临床治疗效果中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述的单克隆抗体用于检测目标患者 肿瘤组织病理切片中的hHR23b蛋白表达量，高表达患者对HDAC抑制剂的治疗响应较好。
7. 根据权利要求5或6任一所述的方法，其特征在于，所述的HDAC抑制剂为 Vorinostat〇
8. 权利要求1或2所述的单克隆抗体及权利要求3所述的杂交瘤细胞在制备判断肿瘤 患者的HDAC抑制剂治疗响应性的试剂盒中的应用。
9. 权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括但不限于前列腺癌、表皮鳞 癌、慢性粒细胞白血病、急性T细胞白血病、脑胶质瘤、宫颈癌、T细胞淋巴瘤、原发性肝癌。
10. 由权利要求8或9所述的方法制备获得的诊断试剂盒。
【文档编号】C12N5/20GK104045712SQ201410247368
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】邱俊康, 聂子梅 申请人:成都正能生物技术有限责任公司, 邱俊康, 聂子梅