一种用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌的方法，属于生物工程【技术领域】。本发明包括：对全局转录因子σ70的编码基因rpoD进行随机突变构建突变文库，转化大肠杆菌进行高通量筛选，获得全局转录因子σ70的突变基因rpoDM1，携带该突变基因rpoDM1的大肠杆菌E.coliJM109/pHACMC9可耐受69%（v/v）的环己烷。本发明通过对全局转录因子σ70进行突变，显著提高了大肠杆菌对环己烷等有机溶剂的耐受性，为提高大肠杆菌等微生物菌株的有机溶剂耐受性提供了方法，为构建耐溶剂性全细胞生物催化剂提供理论依据。
【专利说明】一种用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌菌株的方法，属于生物工程【技术领域】。具体涉及对全局转录因子σ7°的编码基因进行随机突变并构建突变文库，筛选具有良好有机溶剂耐受性的σ 7°突变株。
【背景技术】
[0002]大部分有机溶剂对微生物的生长都有毒害作用，通过破坏细胞质膜并影响其生长代谢最终导致细胞死亡。虽然微生物自身对有机溶剂有一定的耐受性，但一般耐受性比较弱，特别是对一些毒性较强的有机溶剂。因此，研究微生物有机溶剂耐受性机制，提高微生物对有机溶剂耐受性十分重要。目前的研究表明，微生物耐溶剂机制主要包括:细胞膜的有机溶剂外排泵，细胞质膜性质和结构的改变，胞内有机溶剂的降解及转化，胁迫反应机制。
[0003]全局转录机制工程是一种用来获得所需细胞表型的方法，通过对全局转录因子相关的编码基因进行突变，筛选得到所需的细胞表型。2006年,Gregory Stephanopoulos等首次提出利用全局转录机制改变细胞表型，通过对细胞转录调控因子进行突变以扰动整个基因组的转录水平，从而改变细胞表型，提高大肠杆菌对乙醇的耐受性，代谢产物的积累等；通过突变sptl5p因子，提高酵母细胞中葡萄糖向乙醇的转化率同时提高对乙醇的耐受性。此后，国内外研究者也利用全局转录调控机制的方法来获得理想的细胞表型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是通过突变全局转录因子σ '筛选得到能够提高大肠杆菌有机溶剂耐受性的突变菌株，为提高大肠杆菌有机溶剂耐受性提供一种有效方法。
[0005]本发明的技术方案:对pHACM质粒上的基因(编码σ 7°因子)进行突变，将其转化大肠杆菌疋JM109，筛选得到能使大肠杆菌耐受69% (v/v)环己烷的σ 7°突变基因 rpolf1。
[0006]一种获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，步骤为:
(1)以携带野生型rpoD基因的pHACM质粒为模板进行随机突变，获得rpoD突变基因；
(2)IlirpoD突变基因为引物，pHACM为模板，全质粒扩增构建σ 7°基因突变库；
(3)转化大肠杆菌进行高通量筛选，以环己烷为有机溶剂压力，进行液体和琼脂平板交替筛选。
[0007]用所述方法获得的显著有机溶剂耐受性改善的σ7°突变基因rpoi/1，其特点为: Cl)该σ 7°突变基因rpolf1携带三个突变位点，分别为Asp39Glu，Ala72Val和
Thr94Met，其中123位突变产生终止密码子；
(2)携带该σ 7°突变基因rpoi/1的大肠杆菌疋coli JM109/pHACMC9能耐受69% (v/v)环己烷，而普通大肠杆菌在1% (v/v)环己烷条件下就停止生长。
[0008]所述的获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，可适用各种微生物菌株的不同转录因子的定向改造。
[0009]以下是本发明技术方案的详细描述。
[0010]以重组质粒 pHAClVhrpoi^ (Alper H, Stephanopoulos G.Global transcriptionmachinery engineering: a new approach for improving cellular phenotype [J].Metabolic Engineering, 2007,9: 258-267)为模板，构建rpoD 基因的突变文库。将 PCR 扩增得到的rpM突变基因为引物，pHACM-r/7M为模板全质粒扩增得到带有rpoi?突变基因的重组质粒，经消化后转化疋coli JM109感受态细胞，涂布含30 Pg/mL卡那霉素的LB平板，37°C培养过夜。洗脱单菌落，利用平板离心管交替筛选的模式，最后筛选得到显著提高大肠杆菌有机溶剂耐受性的rpolf1。
[0011]野生型O 7°基因的氨基酸序列为:SEQ ID NO:1 ； σ 7°突变基因rpoi/1的氨基酸序列为:SEQ ID NO: 2。
[0012]本发明的有益效果:
1.通过对全局转录因子σ7°进行突变，显著提高了大肠杆菌对环己烷等有机溶剂的耐受性，为提高大肠杆菌等微生物菌株的有机溶剂耐受性提供了方法，为构建耐溶剂性全细胞生物催化剂提供理论依据。
[0013]2.在基因突变库的筛选中，通过优化后使用5 mL离心管代替摇瓶筛选，既节约了实验成本同时也方便了实验操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图突变基因提高大肠杆菌环己烷耐受性的初筛，其中第101号为对照菌株(WT)0
【具体实施方式】
[0015]实施例1 σ 7(1突变基因文库的构建
易错PCR主要是通过降低DNA聚合酶在PCR扩增过程中的保真度而向基因中引入错误碱基。引入的错误碱基被翻译成相应的氨基酸从而导致基因突变。本发明利用Stratagene的随机突变试剂盒(GeneMorphII Random Mutagenesis Kit)来构建基因突变库。
[0016]以重组质粒pHACM-rpoj为模板，易错PCR扩增rpoD基因片段，所采用的引物为: r/7oi?-F:AACCTAGGAG CTCTGATTTA ACGGCTTAAG TGCCGAAGAG C，
rpoD-R\ TGGAAGCTTT AACGCCTGAT CCGGCCTACC GATTA,
PCR反应体系如下:
【权利要求】
1.一种获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，其特征在于步骤为: (1)以携带野生型rpoD基因的pHACM质粒为模板进行随机突变，获得rpoD突变基因； (2)IlirpoD突变基因为引物，pHACM为模板，全质粒扩增构建σ 7°基因突变库； (3)转化大肠杆菌进行高通量筛选，以环己烷为有机溶剂压力，进行液体和琼脂平板交替筛选。
2.用权利要求1所述方法获得的高有机溶剂耐受性改善的σ7°突变基因r/70//1，其特征在于: Cl)该σ 7°突变基因rpolf1携带三个突变位点，分别为Asp39Glu，Ala72Val和Thr94Met，其中123位突变产生终止密码子； (2)携带该σ 70突变基因rpoi/1的大肠杆菌疋coli JM109/pHACMC9能耐受v/v 69%环己烷，而普通大肠杆菌在v/v 1%环己烷条件下就停止生长。
3.根据权利要求1所述的获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，其特征在于:可适用各种微生物菌株 的不同转录因子的定向改造。
【文档编号】C12N15/70GK104004779SQ201410247513
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】倪晔, 钱晓红, 张法 申请人:江南大学