基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法
【专利摘要】本发明提供一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，包括细胞常规培养、细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、将细胞进行染毒处理、进行形态学观察和细胞活性检测等步骤，本发明对于探讨纳米氧化锌的肠道毒性具有一定的理论意义，并为食品用纳米氧化锌限量标准的制定提供参考，为进一步研究食品用纳米氧化锌的安全问题提供可靠的科学依据，为其它纳米材料的安全性评价提供参考。为纳米氧化锌的安全使用提供理论支撑。
【专利说明】基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测领域，具体是一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生 物安全性评价方法。
【背景技术】
[0002] 从当前的研究进展可知，活性氧自由基的产生引起机体氧化应激改变是现今所熟 知的纳米材料的毒性机制。从纳米材料的特性来看：粒径越小，其比表面积越大，反应的活 性位点就越多，更容易产生具有高反应能力的自由基。另外，不同纳米材料理化性质不同、 受测生物体中代谢活动有差异，因此不同纳米材料的致毒机制也不尽相同。除氧化应激机 制外，锌离子的释放、炎症反应应答和表面静电作用等因素都可参与其毒性作用。
[0003] 活性氧自由基是是含有氧的化学反应分子，包括氧离子和过氧化物。作为正常代 谢反应的副产物，在信号转导，维持细胞内稳态方面起着重要作用。然而，在环境因子影响 下（比如紫外照射或者加热)。R0S水平显著增加。这可能导致细胞结构的明显的破坏，被称 做氧化应激反应。
[0004] 正常状态下，细胞会通过A-1微球蛋白，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，乳糖过氧 化物酶，谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物还原蛋白来保护细胞免受氧化应激性损伤。其中 胞内的一些小分子物质例如维生素 C、维生素 E，尿酸和谷胱甘肽对于细胞抗氧化性也起重 要的作用。但在氧化应激条件下，活性氧自由基大量产生，对于细胞损伤主要包括：DNA损 伤、多不饱和脂肪酸氧化、氨基酸氧化和通过氧化辅酶因子使酶失活。最早的研究主要围绕 富勒烯的水悬浊液处理鱼脑组织产生氧化应激反应和脂质超氧化反应。进一步研究发现富 勒烯和其他无机的纳米材料(氧化锌、二氧化钛和氧化铜）也能引起氧化应激反应，在光照 刺激下可以产生更多的R0S，导致更严重的细胞毒性。Ye课题组发现金属铬通过还原反应 产生R0S参与细胞凋亡早期，p53蛋白可以与金属铬产生协同作用进入到细胞凋亡晚期。研 究已表明R0S是p53介导细胞凋亡信号通路的下游信号因子，金属铬可以诱导p53蛋白的 活化，做为肿瘤抑制蛋白，促进细胞凋亡。
[0005] 锌是生物体必不可少的微量元素，机体有良好的调控体系可以平衡体内的锌，而 且锌离子本身化学性质显惰性，因此通常锌都被认为是无毒的。但纳米氧化锌作为金属毒 性中较强的一类纳米材料，引起了人们的关注。Kao等总结了纳米氧化锌释放Zn2+对细胞 产生的毒性机制。前期，纳米氧化锌通过内吞作用进入胞内的内含体，内含体在低浓度的pH 下，释放锌离子到细胞质中。到了后期，线粒体大量吸收锌离子，导致线粒体内的锌离子增 力口，致使线粒体膜破损，激活Caspase-3,产生凋亡同时释放LDH。
[0006] Brunner等采用多种金属氧化物染毒间脾瘤细胞MST0-211H和小鼠成纤维细胞 NIH/3T3。结果表明纳米氧化锌在进入细胞后，纳米氧化锌溶解出锌离子用于NIH/3T3毒 性。Wiseman等研究表明锌离子浓度的升高可以导致肺动脉内皮细胞线粒体损伤。同时表 明锌离子可以激活R0S大量产生，诱导的氧化损伤并进一步反馈于锌离子释放。Deniels研 究发现锌离子可以参与到MAP-激酶途径，产生活性氧，造成神经瘤细胞存活率降低，特别 是在高浓度的锌离子，4 h后即可明显观察到细胞抑制率升高。
[0007] 在纳米复合材料的安全性评价中，有许多不确定性变量。主要存在以下问题：一、 关于染毒的剂量是纳米材料风险与危害评估的主要问题。在经典的毒性实验中，将细胞或 者组织暴露在一定剂量的染毒物，短时间内即可检测细胞的形态学变化、胞内外酶活的变 化，基因的差异性表达等。实验中的剂量效应是关键的因素，剂量可以用来评估药物治疗和 靶细胞或靶器官承受的浓度上限。大量的研究结果说明关于染毒物的剂量导致毒性一有毒 的物质在低浓度下是无毒的，无毒的物质在高浓度下也可以对机体产生危害。那么科学规 范的安全性评价就是采用科学公认的研究方法对纳米材料剂量、暴露途径和时间、确定粒 径大小和形状这些变量的进行详细描述，同时增加实验的可重复性。正在兴起的高通量和 计算机编程的方法应用于拍摄和表征纳米材料用于毒性检测，同时研究材料特征和生物习 性之间的关系。也为计算机研究人员提供了条件来设计合适的软件来描述纳米材料，还可 与毒理学家合作设计新的实验思路。既可以增加毒理实验的重复性，同时方便研究结果之 间相互比较。
[0008] 根据 IS0(The International Organization for Standardization) ΙΟ"3-5 国际 标准医疗器材的生物安全性评估一体外毒性的检测的毒性评价：毒性的效应可以分为定性 评价和定量评价。定性的毒性评价包括观察细胞形态，细胞的空泡化，细胞溶解，细胞膜完 整性，根据细胞的染毒程度可以分为无毒性、轻微毒性、中等毒性、严重毒性。定量的毒性评 价包括：检测细胞死亡、细胞生长抑制率、细胞增殖抑制率和克隆形成率。采用客观的方法 统计细胞数量，蛋白质数量，酶的释放，染料标记细胞。生物相容性检测对生物材料进行生 物安全性评价，纳米材料对宿主是异物，在体内必定会产生某些应答或出现排异现象。体外 分析方法或动物实验可以用于合理地预测在人体的反应，但目前还不能做到这一点。细胞 学检测是目前用于毒性评价、生物材料检测和环境材料接触检测的主要方法。尽管体外模 型与体内观察之间常在相关性和可预见性上欠佳，但目前还没有从材料合成到动物模型的 科学的判断标准。而且在细胞水平上的研究仍然知之甚少：纳米颗粒如何与细胞膜相互作 用，他们如何被转运进细胞、溶酶体、线粒体、细胞核，以及他们之间相互作用的结果。在人 体器官水平上，亟待解决的问题是纳米颗粒进入人体后的肺外转运和迁移的毒理动力学。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方 法。
[0010] 一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于包括如 下步骤： 1) 细胞常规培养：将Caco-2细胞培养于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml链霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每2天进行细胞换液，取对数期 Caco-2细胞进行实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞为贴壁细胞，培养3-4天后，细胞覆盖瓶底80%-90%时，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培养基吹吸 进行终止消化，混合悬液以1/2 -1/3的比例进行分瓶传代； 3) 细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5分 钟，弃上清，缓慢加入冻存液，吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中，可放入垫有棉花的泡沫盒中 直接-80°C超低温冰箱过夜，次日转移到液氮中冻存； 4) 细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离 心，弃上清，再加入10 ml完全培养液培养，次日换液； 5) 将细胞进行染毒处理； 6) 进行形态学观察和细胞活性检测。
[0011] 所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在 于步骤5)中所述将细胞进行染毒处理包括如下步骤：取处于对数生长期的Caco-2,加入 0. 25%胰酶消化，细胞悬液为2 X 105/ml，200 μ 1接种于96孔板中，培养24 h，三种粒径的 纳米氧化锌按照稀释浓度6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml加入96孔板中，分别培养24小 时，同时设置不含纳米氧化锌的DMEM培养细胞作为对照组。
[0012] 所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于 步骤6)中细胞活性检测包括如下步骤：收集对数期细胞，调整细胞悬液密度至2 X 105/ml， 96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培养液，5% C02, 37 °C孵育，细胞生长12 h后，加入浓 度梯度的三种粒径的纳米氧化锌，设置4个复孔，分别染毒12 h，24 h和36 h，吸弃含有纳米 氧化锌的染毒上清液，用PBS冲洗2-3次，加入0. 05 mg/ml，lx PBS稀释的200 μ 1 MTT染 色液继续培养4 h，弃掉ΜΤΤ上清液，加入150 μ 1 DMS0,置摇床上低速震荡10 min，使紫色 结晶物充分溶解，在酶标仪570 nm测定吸光度，同时设置调零组：DMEM，MTT染色液，DMS0， 对照组：Cac〇-2细胞，DMEM，MTT染色液，DMS0,使用SPSS 16. 0软件对实验结果进行统计分 析，计算P〈 〇· 〇1的差异显著性，MTT细胞活性=(Aexp-Aneg) / (A con-A neg)，其中，Aexp 代表试验组，Aneg代表调零组，Aeon代表实验对照组。
[0013] 所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于 步骤1)中的细胞培养条件是5% C02 , 37 °C恒温。
[0014] 所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于 步骤3)中所述冻存液采用如下配方：50%胎牛血清，40% DMEM培养液，10%二甲基亚砜 DMS0。
[0015] 本发明的基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，对于探讨纳米 氧化锌的肠道毒性具有一定的理论意义，并为食品用纳米氧化锌限量标准的制定提供参 考，为进一步研究食品用纳米氧化锌的安全问题提供可靠的科学依据，为其它纳米材料的 安全性评价提供参考。为纳米氧化锌的安全使用提供理论支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是纳米氧化锌对Caco-2细胞形态的影响图； 图2是纳米氧化锌染毒Caco-2细胞12h后细胞活力比较图； 图3是纳米氧化锌染毒Caco-2细胞24h后细胞活力比较图； 图4是纳米氧化锌染毒Caco-2细胞36h后细胞活力比较图； 图5是25 Pg/ml氧化锌染毒Caco-2细胞活力比较图； 图6是5(^g/ml氧化锌染毒Caco-2细胞活力比较图。
【具体实施方式】
[0017] 材料 细胞株 人结肠腺癌上皮Caco-2细胞 中科院上海细胞生物研究所 主要试剂 纳米氧化锌颗粒 杭州万景新有限公司 L-谷氨酰胺 Hyclone分装 青霉素 美国Sigma分装 链霉素 美国Sigma分装 丝裂霉素 C 瑞士 Roche分装 DMEM 美国Hyclone公司 二甲基亚砜（DMS0) 美国Hyclone公司胎牛血清 杭州四季青生物技术有限公司 lOxPBS 碧云天生物技术有限公司 MTT试剂盒 碧云天生物技术有限公司 0.25%胰酶 碧云天生物技术有限公司1. 5ml, 15ml，50ml离心管 美国Corning公司 25cm和75cm细胞瓶 美国Corning公司 6孔板，24孔板和96孔板 美国Corning公司 主要仪器 JEM-1011型透射电镜 日本JE0L公司 倒置生物显微镜 日本Olympus公司 Genios酶标仪 瑞士 TECAN公司 超纯水设备 美国Millipore公司 SW-CJ-1F超净工作台 中国苏州净化公司 HH-4数显恒温水浴锅 中国精达仪器 LD5_2A尚心机 北点医用尚心机J^ 二氧化碳恒温培养箱 美国Thermo公司 实验方法 细胞培养 细胞常规培养：Cac〇-2细胞培养于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml链霉素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培养基。细胞培养条件设置为5% C02, 37 °C恒 温。每2天进行细胞换液，取对数期Caco-2细胞进行实验。
[0018] 细胞传代：Caco-2细胞为贴壁细胞。培养3-4天培养后，细胞覆盖瓶底80%-90% 时，采用0. 25%胰酶37 °C消化。镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培 养基吹吸进行终止消化。混合悬液以1/2 -1/3的比例进行分瓶传代。
[0019] 细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5 分钟，弃上清。缓慢加入冻存液（50%胎牛血清，40% DMEM培养液，10%二甲基亚砜DMS0)， 吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中。可放入垫有棉花的泡沫盒中直接_80°C超低温冰箱过夜， 次曰转移到液氮中冻存。
[0020] 细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离 心，弃上清。再加入10 ml完全培养液培养，次日换液。
[0021] 细胞染毒处理 处于对数生长期的Caco-2,加入0. 25%胰酶消化，细胞悬液为2 X 105/ml。200 μ 1接 种于96孔板中，培养24 h。三种粒径的纳米氧化锌按照稀释浓度（6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml)加入96孔板中，分别培养24小时，同时设置不含纳米氧化锌的DMEM培养细胞作为 对照组。
[0022] 形态学观察 处于对数生长期的细胞，采用三种纳米氧化锌(浓度为6. 25,12. 5, 25, 50和100 Pg/ mL)染毒24 h，倒置显微镜下镜检。对照组细胞只加入相应不含胎牛血清的DMEM培养液。
[0023] 细胞活性检测 实验方法：收集对数期细胞，调整细胞悬液密度（2 X 105/ml)，96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培养液，5% C02 , 37 °C孵育，细胞生长12 h后，加入浓度梯度的三种粒径的纳米 氧化锌，设置4个复孔，分别染毒12 h，24 h和36 h，吸弃含有纳米氧化锌的染毒上清液，用 PBS冲洗2-3次，加入200 μ 1 MTT染色液（0· 05 mg/ml，lx PBS稀释）继续培养4 h。弃掉 MTT上清液，加入150 μ 1 DMS0,置摇床上低速震荡10 min，使紫色结晶物充分溶解。在酶标 仪570 nm测定吸光度。同时设置调零组（DMEM，MTT染色液，DMS0)，对照组（Caco-2细胞， DMEM，MTT染色液，DMS0)。使用SPSS 16. 0软件对实验结果进行统计分析，计算p〈 0. 01的 差异显著性。
[0024] MTT 细胞活性=(Aexp-Aneg) / (A con_A neg) 其中，Aexp代表试验组，Aneg代表调零组，Aeon代表实验对照组。
[0025] 结果 细胞形态学观察 纳米氧化锌对Caco-2细胞形态的影响如图1所示，其中A :空白组，B :50Pg/mL丝裂霉 素 C，C :25 Pg/mL 26 nm纳米氧化锌，D: 100Pg/mL 26 nm纳米氧化锌。纳米氧化锌与阳性对 照药物分别作用Caco-2细胞24 h后，镜检拍照可知，对照组细胞生长良好，细胞贴壁牢固， Caco-2细胞为50-60 μπι呈梭形或多角形，形成单层细胞模型（图1A)。如图1B所示丝裂 霉素 C作为阳性对照药物染毒Caco-2细胞后结果表示细胞数量明显减少，细胞变圆，和细 胞浓度变稀，抑制作用明显。如图1 B经25 Pg/mL的氧化锌染毒，细胞形态尚无明显变化， 细胞折光率变差，细胞表面变"脏"。镜下可见一些细胞变圆，变圆发亮，细胞呈不规则形态。 100 Pg/mL的氧化锌附着细胞周围，一些细胞变小、变圆，呈坏死的形态，细胞不同程度地破 碎，出现空泡化。镜下细胞贴壁力下降，细胞数量减少，视野中出现黑色的团聚纳米氧化锌 颗粒。
[0026] 染毒Caco-2细胞12小时细胞存活率 Caco-2细胞经不同浓度的三种纳米氧化锌处理12h后，细胞活性比较随纳米氧化锌浓 度升高而降低。表1表示在低剂量水平上（6. 25 Pg/mL和12. 5 Pg/mL)三种纳米氧化锌的 细胞存活率与对照组无明显差异。随着剂量的增加（>25Pg/mL)，实验组的细胞存活率严重 降低。在一定浓度范围内（彡50 Pg/mL)，62 nm氧化锌的细胞存活率高于26 nm和90 nm氧 化锌，差异具有统计学意义（P〈〇. 01 )。
[0027] 表1纳米氧化锌染毒Caco-2细胞12小时后MTT 0D值与细胞存活率（RGR)
【权利要求】
1. 一种基于CaC〇-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于包括如下 步骤： 1) 细胞常规培养：将Caco-2细胞培养于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml链霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每2天进行细胞换液，取对数期 Caco-2细胞进行实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞为贴壁细胞，培养3-4天后，细胞覆盖瓶底80%-90%时，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培养基吹吸 进行终止消化，混合悬液以1/2 -1/3的比例进行分瓶传代； 3) 细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5分 钟，弃上清，缓慢加入冻存液，吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中，可放入垫有棉花的泡沫盒中 直接_80°C超低温冰箱过夜，次日转移到液氮中冻存； 4) 细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离 心，弃上清，再加入10 ml完全培养液培养，次日换液； 5) 将细胞进行染毒处理； 6) 进行形态学观察和细胞活性检测。
2. 如权利要求1所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其 特征在于步骤5)中所述将细胞进行染毒处理包括如下步骤：取处于对数生长期的Caco-2， 加入0. 25%胰酶消化，细胞悬液为2 X 105/ml，200 μ 1接种于96孔板中，培养24 h，三种粒 径的纳米氧化锌按照稀释浓度6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml加入96孔板中，分别培养 24小时，同时设置不含纳米氧化锌的DMEM培养细胞作为对照组。
3. 如权利要求1所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其 特征在于步骤6)中细胞活性检测包括如下步骤：收集对数期细胞，调整细胞悬液密度至2 X 105/ml，96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培养液，5% C02 , 37 °C孵育，细胞生长12 h后， 加入浓度梯度的三种粒径的纳米氧化锌，设置4个复孔，分别染毒12 h，24 h和36 h，吸弃 含有纳米氧化锌的染毒上清液，用PBS冲洗2-3次，加入0. 05 mg/ml，lx PBS稀释的200 μ 1 ΜΤΤ染色液继续培养4 h，弃掉ΜΤΤ上清液，加入150 μ 1 DMSO,置摇床上低速震荡10 min， 使紫色结晶物充分溶解，在酶标仪570 nm测定吸光度，同时设置调零组：DMEM，MTT染色液， DMS0,对照组：Cac〇-2细胞，DMEM，MTT染色液，DMS0,使用SPSS 16. 0软件对实验结果进行 统计分析，计算P〈 〇. 01的差异显著性，MTT细胞活性=(Aexp-Aneg)/ (A con-Aneg)，其中， Aexp代表试验组，Aneg代表调零组，Aeon代表实验对照组。
4. 如权利要求1所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其 特征在于步骤1)中的细胞培养条件是5% C02 , 37 °C恒温。
5. 如权利要求1所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其 特征在于步骤3)中所述冻存液采用如下配方：50%胎牛血清，40% DMEM培养液，10%二甲 基亚讽DMS0。
【文档编号】C12Q1/02GK104059961SQ201410247688
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】关荣发, 康天舒, 王彦波, 伍义行, 吕飞, 张进杰 申请人:中国计量学院