适度表达新型枯草芽孢杆菌nadh氧化酶高效发酵生产乙偶姻的制作方法
【专利摘要】适度表达新型枯草芽孢杆菌NADH氧化酶高效发酵生产乙偶姻，属于基因工程和发酵工程领域。本发明通过本实验室自主筛选的具有独立知识产权的高产乙偶姻菌株B.subtilis?JNA基因组中首次发现新型NADH氧化酶，在确定该酶酶学性质的同时，通过适度表达载体pMA5-PbdhA，将NADH氧化酶在bdhA基因缺失型枯草芽孢杆菌中进行表达，最终利用代谢工程改造后的重组菌发酵生产乙偶姻，获得约56.7g/L乙偶姻和1.2g/L2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少约92.3％、70.1％和75.0％，乙偶姻生产效率上升到0.68g/(L·h)，较原始菌株发酵周期缩短1.7倍。为国内外首次在枯草芽孢杆菌中利用NADH调控生产乙偶姻，实现了缩短发酵周期、减少NADH依赖型副产物的目的。
【专利说明】适度表达新型枯草芽孢杆菌NADH氧化酶高效发酵生产乙偶姻
【技术领域】
[0001]利用适度表达新型NADH氧化酶减少NADH依赖型副产物提高乙偶姻产量，本发明属于基因工程和发酵工程领域。具体涉及一种新型NADH氧化酶的筛选、基因工程菌的构建及其发酵生产。
技术背景
[0002]乙偶姻天然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中。是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，因此乙偶姻主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，或直接用于奶制品。我国国家标准GB2760-86明确规定其为允许使用的食品级香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。
[0003]目前，传统的发酵技术已经成为我国现阶段食用香料行业的研究热点。利用微生物发酵生产香料的基本原理是:通过微生物的自身代谢和微生物生长过程中产生的酶进行的催化作用，经过一系列复杂的生物化学反应，使各种有机物转化为多种具有芳香气味的化合物。目前国内外研究表明某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽抱杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。深入的研究。 [0004]本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌B.subtilisJNA (保藏号CCTCC M209309 ;专利申请公布号CN101864381A)，在研究中发现其发酵过程会形成部分NADH依赖型副产物，如乳酸、乙醇及2，3- 丁二醇，导致乙偶姻产量无法进一步提高，因此考虑通过降低胞内NADH水平来减少这些副产物的生成。NADH氧化酶(Ν0Χ，ECl.6.99.3)可以催化NADH形成NAD+，因此该酶被广泛的应用到NADH依赖型代谢途径流量的重排上面。但是目前为止，关于枯草芽孢杆菌中NOX的研究还未见报道。
[0005]本发明首次报道了来自于自枯草芽孢杆菌的新型NADH氧化酶，在确定该酶相关性质的同时，通过本实验室构建的枯草芽孢杆菌适度表达载体pMA5-PbdhA (专利申请公布号CN102876703A)，将NADH氧化酶在bdhA基因缺失型菌株中进行表达。在bdhA基因缺失型菌株中，利用适度表达新型NADH氧化酶,达到缩短发酵周期,减少NADH依赖型副产物的目的，最终实现适度表达NOX的工程菌株高效生产乙偶姻。
【发明内容】
[0006]本发明所使用的原始菌种为B.subtilis JNA，该菌株前期发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，后期逆向转化为乙偶姻，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉，武汉大学；保藏编号为:CTCCM209309。[0007]本发明的主要研究内容:本发明利用分子技术克隆了来自枯草芽孢杆菌的4个假定的NADH氧化酶(简称Ν0Χ)，构建重组表达载体并将其转化至B.subtilis JNA,通过酶活力测定及相关酶学性质鉴定，确定来源枯草芽孢杆菌的yodC基因为编码形成水的NADH氧化酶。构建适度表达载体pMA5-PbdhA-yodC，并将其转化至bdhA基因缺失型B.subtilis JNA,成功构建了适度表达NOX的工程菌株。最终，利用在bdhA基因缺失型菌株中适度表达NADH氧化酶发酵生产乙偶姻，将150g/L葡萄糖转化约为56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少92.3%、70.1%和75.0%，乙偶姻生产效率上升到0.68g/(L.h)，较原始菌株B.subtilis JNA发酵周期缩短1.7倍。
[0008]本发明的优点和积极效果是:
[0009](I)本发明首次报道了来自枯草芽孢杆菌的新型NADH氧化酶，并确定了该酶酶学相关性质，为枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻减少NADH依赖型副产物提供了一定的理论可倉泛。
[0010](2)本发明通过在bdhA基因缺失型菌株中适度表达NADH氧化酶，实现高效生产乙偶姻的方法，最终适度表达NADH氧化酶的工程菌株将150g/L葡萄糖转化为约56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇、乳酸和乙酸分别减少约92.3%、70.I %和75.0%，乙偶姻生产效率上升到约0.68g/(L.h)，较原始菌株B.subtilis JNA发酵周期缩短1.7倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1质粒T-bdhA::cat构建示意图。
[0012]图2SDS-PAGE 验证 NADH 酶在 B.subtilis JNA 中纯化。
[0013]M,蛋白 Marker ；1, B.subtilis JNA ;2, B.subtilis JNA/pMA5-yodC 粗酶液；3，B.subtilis JNA/pMA5粗酶液；4_8，不同咪唑浓度下洗脱的NOX纯酶，其中咪唑浓度依次为Ommol /T,, 20mmol/L, SOmmoI /T,, 100mmol/L, 300mmol/L
[0014]图3N0X的表达对胞内NADH和NAD+含量及其比例的影响。
[0015]BM，bdhA 基因缺失的 B.subtilis JNA ;BMNQ，BM/pMA5_Pbdh4-yodC ;BMN ;BM/pMA5-yodC
【具体实施方式】
[0016]实施例1:利用基因工程手段构建bdhA基因缺失型菌株
[0017]构建报告基因插入失活的bdhA基因片段，利用引物Pl和P2从pBGSC6质粒上克隆得到cat基因的完整表达基因片段，然后利用ECOR47III处理胶回收的片段，最后用碱性磷酸酶处理该基因片段并与经过同样处理后的T-bdhA连接，转化大肠杆菌JM109，在氨苄青霉素和氯霉素双抗性平板上筛选阳性克隆。将构建好的T-bdhA::cat转化B.subtilisJNA,在氯霉素平板上筛选得到bdhA基因缺失的重组菌株，经菌落PCR及酶活力验证实验，确认bdhA基因是否被成功插入失活。
[0018]Pl:5’ -CGCAGCGCTAAAAAAGGATTGATTCTAATG-3’ (Eco47III)
[0019] P2:5， -CGCAGCGCTTAGTGACATTAGAAAACCGAC-3， (Eco47III)
[0020]结果表明，菌落PCR及酶活力验证正确，且下游副产物2，3- 丁二醇产量显著降低，成功获得bdhA基因缺失型菌株。
[0021 ] 实施例2 =NADH氧化酶引物设计
[0022]首先，以菌株B.subtilis JNA的染色体DNA为模板，利用引物P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10，通过PCR技术分别扩增得到一段的ydfN，ydgl，yodC和yfhC基因，将纯化后的ydfN，ydgl, yodC和yfhC基因经限制性内切酶MluI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒PMA5连接，构建重组质粒pMA5-bdhA，在T4DNA连接酶的作用下16°C过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coli JM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒pMA5_ydfN, pMA5-ydgI, pMA5_yodC和pMA5-yfhC构建成功。经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。将重组质粒A5-ydfN，pMA5-ydgI, pMA5-yodC和pMA5_yfhC以化学转化的方法转化至B.subtiIis JNA,挑取阳性转化子，即得到重组枯草芽抱杆菌 B.subti I i s JNA/pMA5-ydfN> B.subtilis JNA/pMA5-ydgI>B.subtilis JNA/pMA5-yodC 和 B.subtilis JNA/pMA5-yfhC?
[0023]以B.subtilis JNA基因组总DNA为模板，设计八条引物，PCR扩增引物设计如下:
[0024]P3:5， -ACCGGGATCCATGGCTGAATTTACTCAT-3’ (BamHI)
[0025]P4:5，-ACCGAC GCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATATACTCAACAAAC-3’ (MluI)
[0026]P5:5， -ACCGGGATCCATGATCAAAACAAACGAT-3> (BamHI)
[0027]P6:5， -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCCATTCTGCAAT-3> (MluI)
[0028]P7:5， -ACCGGGATCCATGACGAATACTCTGGAT-3> (BamHI)
[0029]P8:5， -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGCCAAGTTGATAC-3’ (MluI)
[0030]P9:5， -ACCGGGATCCATGCCTCAAACCGAACAA-3> (BamHI)
[0031]PlO:5’ -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTTCAGTGAATCG-3’ (MluI)
[0032]实施例3 =NADH氧化酶活力测定
[0033]将实施例4 构建的重组菌 B.subtilis JNA/pMA5-ydfN, B.subtilis JNA/pMA5-ydgI, B.subtilis JNA/pMA5-yodC 和 B.subtilis JNA/pMA5-yfhC,与出发菌株B.subtilis JNA分别接种于IOmL含卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日按4%的接种量转接于LB培养基中，37°C培养24h，取发酵液于4°C，10000r/min离心10min，pH7.0的磷酸钠缓冲液清洗3次，细胞重悬于pH6.5磷酸钠缓冲液中，随后将该液体置于超声波破碎仪下处理细胞20min，15000r.mirT1离心30min，上清即为粗酶液。将20 μ I粗酶液加入到酶活测定缓冲体系中立即检测A34tl吸光值的变化。
[0034]NADH氧化酶活力测定:酶反应体系为lmL，含有50mmol/L磷酸钾(ρΗ7.0)，0.3mmol/L EDTA, 50 μ mol/L FAD和0.3mmol/L β -NADH ;酶促反应在加入一定量的酶液后立即开始，酶活力单位(IU)定义为在25°C条件下，每分钟氧化Iymol的NADH所需的酶量。
[0035]结果表明重组菌B.subtilis JNA/pMA5_yodC表达的NADH氧化酶比酶活为9.65U/mg,比出发菌株B.subtilis JNA的NADH氧化酶比酶活提高了 12倍，其余重组菌株与出发菌株B.subtilis JNA相比无明显提高，表明yodC基因可能为枯草芽孢杆菌中的NOX编码基因。
[0036]实施例4 =NADH氧化酶酶学性质分析
[0037](I)催化类型鉴定
[0038]NADH氧化酶有三种催化类型，在反应体系中除了会生成产物NAD+，还会生成水、过氧化氢或者超氧化物等。通过在标准的NADH氧化酶酶促反应液中检测是否生成水、过氧化氢或者超氧化物确定该酶的催化类型。其中过氧化氢检测利用H2O2测试条比较过氧化物标准颜色定性是否生成H2O2，超氧化物通过检测A55tl下细胞色素C的减少变化定性是否生成超氧化物。结果表明，反应过程未检测出过氧化氢或者超氧化物，间接表明该酶是形成水的NADH氧化酶。
[0039](2)最适pH的研究
[0040]配制不同pH梯度的缓冲液(pH4.5-5.5:50mM醋酸钠-乙酸缓冲液；ρΗ5.5-9.0:50mM磷酸钠缓冲液；pH9.0-10.5:50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，每(λ 5pH为一个梯度)，与 0.3mmol/L EDTA, 50 μ mol/L FAD 和 0.3mmol/L β -NADH 混合，取 2mL 不同 pH 底物缓冲液与20 μ L酶液进行反应，测定不同pH条件下的酶相对活力，并进行比较。结果表明，该酶的最适pH为9.0，中性偏碱的环境较适合该酶的催化，酸性或强碱环境下酶活力迅速下降。[0041 ] (3)酶的pH稳定性的研究
[0042]配制不同pH梯度的缓冲液(pH4.5-5.5:50mM醋酸钠-乙酸缓冲液；ρΗ5.5-9.0:50mM磷酸钠缓冲液；pH9.0-10.5:50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，每(λ 5pH为一个梯度)。将酶存放于不同PH环境中，每隔一定时间取样，测定该酶的pH稳定性。结果表明，在中性pH环境范围(ρΗ6.0~8.0)，该酶较稳定。
[0043](4)最适温度的研究 [0044]设置反应温度(25°C_65°C，每5°C为一个梯度)测定不同温度条件下酶活力，确定该酶反应最适温度。结果表明，该酶的最适反应温度为35°C。
[0045](5)热稳定性研究
[0046]将酶液分别存放在-20°C、0°C、200C>30°C、40°C、50°C、60°C环境下，每隔 Ih 取
样，测定不同温度下酶的剩余活力，从而研究该酶在不同温度下的热稳定性。结果表明，在-20°C环境下该酶最稳定，随着温度的升高，酶的稳定性逐步减弱，到60°C时相对酶活力已经小于10%。
[0047](6)不同金属离子、EDTA及奎宁对酶活的影响
[0048]以不加金属离子的反应体系为对照，分别在反应体系中加入终浓度为ImM和IOmM的 Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Fe3+ 离子、EDTA 以及奎宁，研究各金属离子及 EDTA对酶活力的影响。结果表明，这些离子及EDTA对该酶没有明显的抑制或者促进作用，表明该酶的催化中心不需要金属离子，而在奎宁存在的情况下，该酶完全失活，间接的表明该酶属于黄素蛋白家族。
[0049](7)酶的动力学参数
[0050]分别在pH9.0和35°C条件下，分别通过改变NADH的底物反应体系终浓度，测定酶活力，考察酶反应速率。通过非线性最小二乘回归方法获得NADH的Kn^PVmaxtl结果表明，NADH 的 Km 为 0.36mmol/L, Vmax 为 19.8 μ mol/L.min。
[0051]实施例5:构建适度表达NADH氧化酶的bdhA基因缺失型重组菌株
[0052]利用引物P11/P12从枯草芽孢杆菌JNA中引物克隆得到yodC基因，利用适度启动子PbdhA (专利申请公布号CN102876703A)将NOX在bdhA基因缺失型菌株中进行表达，最终获得重组菌株适度表达NADH氧化酶的重组菌株，结果表明，适度表达NOX使胞内的NADH水平下降约21.5%, NADH/NAD+比例下降超过37.9%，但对细胞的生长和糖耗速率影响较小，并且该策略大大提高了发酵前期的葡萄糖比消耗速率，最终使得该菌在84h就消耗了 150g/L的葡萄糖，因此该策略适合于用来调节NADH依赖型发酵产物的代谢流。
[0053]Pll:5’ -ACCGGGTACCATGACGAATACTCTGGAT-3> (KpNI)
[0054]P12:5’ -ACCGAAGCTTTTACAGCCAAGTTGATAC-3> (Hind III)
[0055]实施例6:适度表达NOX的工程菌株发酵生产乙偶姻、2，3_丁二醇及副产物性能检测
[0056]适度表达NOX的工程菌株接种于IOmL LB培养基中，37°C振荡培养7_9h后，各取Iml转接于3瓶50ml含40g/L葡萄糖的LB培养基中37°C振荡培养，当培养至0D_ =
5.0-6.0时，加入至含1.85L发酵培养基的5L发酵反应器中进行发酵，控制发酵初始pH分别为6.0、6.5及7.0,确定最适生长pH为6.5后，在生长最优条件pH6.5条件下发酵48h后，提高pH至7.5，8.0和8.5继续发酵，每12h取样一次，检测发酵生长情况、糖耗速率、乙偶姻、2，3- 丁二醇及副产物产量。
[0057]枯草芽孢杆菌发酵培养基:牛肉浸膏5g/L,玉米衆6g/L,尿素2g/L,葡萄糖150g/L0 调节 pH6.5。
[0058]结果表明，适度表达NADH氧化酶不仅促进了糖酵解的进行还降低了发酵过程中NADH依赖型副产物2，3_ 丁二醇、乳酸和乙醇的产量，促进了乙偶姻的合成。最终适度表达NOX的工程菌株利用150g/L葡萄糖发酵84h得到了 56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3- 丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少92.3%、70.1%和75.0%，乙偶姻生产效率上升到 0.68g/(L.h)，较原始菌株重组菌B.subtilis JNA发酵周期缩短1.7倍。
【权利要求】
1.一种bdhA基因缺失型枯草芽孢杆菌(B.subtilis),其特征在于:从pBGSC6质粒上克隆得到cat基因的完整表达基因片段，利用碱性磷酸酶处理该基因片段并与经过同样处理后的T-bdhA连接，构建SEQ ID NO:1所示的因报告基因插入而失活的bdhA基因片段，然后将构建好的T-bdhA::cat转化至保藏编号为CCTCC NO:M209309的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA中，筛选获得一种bdhA基因缺失型枯草芽孢杆菌。
2.一种新型枯草芽孢杆菌NADH氧化酶，其特征在于:将SEQ ID NO:2所示的NADH氧化酶基因yodC克隆到表达穿梭载体pMA5构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-yodC并转化至保藏编号为CCTCC NO:M209309的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA中，经酶活力测定及相关酶学性质鉴定，确定yodC即为编码枯草芽孢杆菌形成水的NADH氧化酶基因。
3.一种适度表达NADH氧化酶的bdhA基因缺失型重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，其特征在于^fSEQ ID NO:2所示的NADH氧化酶基因yodC克隆到适度表达穿梭载体pMA5-PbdM构建成为重组穿 梭表达质粒pMA5-PbdM-yodC并转化至权利要求1所述枯草芽孢杆菌中，构建适度表达NADH氧化酶的bdhA基因缺失型菌株。
4.权利要求3所述的菌株在发酵生产乙偶姻中的应用，其特征是:最终将150g/L葡萄糖转化约为56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少.92.3%,70.1%和75.0%，乙偶姻生产效率上升到0.68g/(L.h)，较原始菌株B.subtilisJNA发酵周期缩短1.7倍。为国内外首次在枯草芽孢杆菌中利用NADH调控生产乙偶姻，实现了缩短发酵周期、减少NADH依赖型副产物的目的。
【文档编号】C12R1/125GK104017758SQ201410249907
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 张显, 包腾, 赵晓静, 杨套伟, 徐美娟 申请人:江南大学