一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开具有高特异性和高亲和力的糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其制备方法。糖化血红蛋白GHb核酸适体的核苷酸序列包括有SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一条序列。糖化血红蛋白GHb的核酸适体制备方法包括：构建随机序列寡核苷酸库、制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物、初次筛选靶物质-核酸复合物、制备次级单链DNA寡核苷酸库、筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体。制备获得的核酸适体无毒性，分子量小，易于合成与标记，只特异性识别糖化血红蛋白GHb，对其他同源非糖化血红蛋白Hb不识别结合，可成为检测糖化血红蛋白GHb含量的分子信标。
【专利说明】-种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法
[0001] 本申请是"一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法"的分案申请，该原申请的 申请日为2012年11月14日、申请号为2012104568467、发明创造名称"一种糖化血红蛋白 的核酸适体及其制备方法"。
【技术领域】
[0002] 本发明属于蛋白检测【技术领域】，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力 的糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其制备方法。
【背景技术】
[0003] 糖尿病是人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症 是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。传统的糖尿病诊断和治 疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的 瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白（GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病 治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白 糖化反应的产物。形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb 含量也会相对较高.正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正 t匕。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖 接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2~3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协 会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识， 更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖 尿病并发症的发生发展尤为重要。
[0004] 目前常用的糖化血红蛋白的检测方法有两大类：高压液相方法（HPLC)和免疫方 法。高压液相方法（HPLC)所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及；微 柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠 佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE 等）对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，且要仔细观察图谱，所以该法得不到普 遍采用。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三 酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由 动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异；抗体对温度湿度敏感，易变性 难保存等缺点，也得不到广泛使用。
[0005] 核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关 注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方 法和技术已被报道；核酸适配体药物"Macugen"也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX 技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子，国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸 识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸（由两端的 固定序列和中间的随机序列组成）文库，通过施加选择压力（结合靶目标，淘选与靶目标 高度特异结合片段的过程），并结合体外扩增技术，经过多轮的循环选择富集，获得与 靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25飞0个核 苷酸。
[0006] 核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性，使其在疾病诊断中具有 良好的应用前景，尽管目前成熟的临床应用报道较少，但应用适体检测靶蛋白的研究却 不断增多，基于适体的检测新技术也不断出现。专利CN201010580661.8,名称为蛋白酪 氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体及其制备方法，公布了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体 的序列特征，通过设计合成单链DNA随机寡核苷酸库、筛选目的寡核苷酸序列、流式分析 鉴定等步骤制备出蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体。专利CN201110148431. 9和专利 CN201110148603. 2,公布了 HCV E1E2蛋白的和HCV NS5A蛋白核酸适体及其衍生物、筛选方 法和应用，其中核苷酸适体衍生物包括取代后的RNA核酸适体、骨架改造后的衍生物、改造 为肽核酸后的衍生物以及连接上放射性分子后的衍生物。专利CN201210214996. 7,公布了 可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用，公开了一种用 前述微流控芯片筛选所述核酸适体的筛选方法，包括优化核酸文库、初筛、纯化、循环几个 主要步骤，该发明的检测方法具有高亲和力和高特异性的优点。
[0007] 由上可知，核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子 药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针 对于糖化血红蛋白GHb的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于糖化血红蛋白GHb的核 酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有的糖化血红蛋白检测技术的不足，填补还未 见糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种糖化血红蛋白GHb核酸 适体及其制备方法，本发明所提供的核酸适体为SEQ ID NO: 1?SEQ ID N0:4所示，分别命名 GHbl、GHb2、GHb3、GHb4。
[0009] 本发明的方案是通过这样实现的： 一种糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列为SEQ ID N0: 4所示的DNA片段序列，命名为GHb4,其序列为： SEQ ID NO:4 ：gggaggcatg ggaaacaatg cgccgcagag ttggaaccc〇
[0010] 一种制备以上任一所述的糖化血红蛋白核酸适体方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为105~106的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列N25~6(l为25~60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将有活化氨基的微磁珠与糖化血红蛋白按照 0. 05~0. 2ml: lmg的比例在偶联缓冲液中混合，再加入10(T200ul偶联剂溶液，25° C反应条 件下轻混2(Γ30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液 洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物； (3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将2~5nmol单链DNA随机序列寡核苷酸库溶于结 合缓冲液，进行加热处理，单链DNA文库与没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结 合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后 收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育15~40min，用洗脱缓冲 液洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异 结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92° C孵育 5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。
[0011] (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列 的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变 性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选。
[0012] (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过12~20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所 述目标寡核酸序列，通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与糖化血红蛋白结合的特异性 和亲和力。
[0013] 以上所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体方法，所述的PCR扩增用到的 PCR引物序列为： 引物 1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3' 引物 2 :5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' 所述的PCR扩增引物2的5'端含生物素标记； 所述PCR扩增工艺条件为：94°C预变性5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 1(T25个循环，最终延伸反应为72°C lOmin。
[0014] 以上所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体方法，所述的偶联缓冲液为含20mM 磷酸钾盐缓冲液，0. 15MNaCl，ImMDTT，pH5. 5;所述偶联剂溶液为含57%的二甲基氨 基丙基乙基碳酰胺；所述结合缓冲液为含100 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 7. 6，2 mM MgCl2, 5mM KC1, 1 mM CaCl2,0.02% Tween 20，1 mM DTT;所述热处理为 90 °C 加热 lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min;所述洗脱缓冲液为含20 mM Tris-HCl pH7. 6， 200 mM NaCl，10 mM EDTA。
[0015] 以上所述的糖化血红蛋白核酸适体或者所述的制备得到的糖化血红蛋白核酸适 体，其特征在于，所述的核酸适体用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血 红蛋白的试剂盒中。
[0016] 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种以上任一所述糖化血红蛋白核酸适体 的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种 ： (1) 将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基 化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2) 权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3) 权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4)权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。
[0017] 以上所述的一种糖化血红蛋白核酸适体衍生物，其特征在于，所述的核酸适体或 者其衍生物用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒中。
[0018] 本发明的实质性特点和显著进步是：（1)所筛选到的核酸适体分子量小，无毒性， 有利于分子探针的设计，易于合成与标记；（2)核酸适体只特异的识别糖化血红蛋白，不结 合非糖化血红蛋白和其它糖化蛋白质分子，结合糖化血红蛋白的能力是结合非糖化血红蛋 白Hb的能力的2(Γ80倍，可以成为鉴别糖化血红蛋白的试剂，提高检测方法的特异性和灵 敏度，简化检测方法，降低成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHbl与糖化血红蛋白 的结合能力曲线。图1中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为0D相对值， 代表核酸适体GHbl与糖化血红蛋白的结合曲线代表核酸适体GHbl与非糖化血 红蛋白Hb的结合曲线。
[0020] 图2.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb2与糖化血红蛋白的结合能力曲 线。图2中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为0D相对值，代表核酸适体GHb2与糖 化血红蛋白的结合曲线，代表核酸适体GHb2与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。
[0021] 图3.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb3与糖化血红蛋白的结合能力曲 线。图3中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为0D相对值，#代表核酸适体GHb3与糖 化血红蛋白的结合曲线，代表核酸适体GHb3与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。
[0022] 图4.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb4与糖化血红蛋白的结合能力曲 线。图4中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为0D相对值，4代表核酸适体GHb4与糖 化血红蛋白的结合曲线，代表核酸适体GHb4与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。下述实施例中所使用 的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊 说明，均可以从商业途径中得到。
[0024] 实施例1糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHbl的制备 (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为IX 105的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列N25~4(l为25~40个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将0. 25ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化 血红蛋白在偶联缓冲液（20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15MNaCl，ImMDTT，pH5. 5)中混合， 加入lOOul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混20小 时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血 红蛋白-微磁珠复合物。
[0025] (3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将2nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgC12, 5mM KC1, 1 mM CaC12, 0. 02% Tween 20, 1 mM DTT)，进行加热处理，90 °C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA 文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液 体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核 苷酸库在结合缓冲液中37°C温育30min，用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mM NaCl，10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白 结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓 冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。
[0026] (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷 酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行 分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； PCR 扩增工艺条件为：94°C 预变性 5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 16 个循环，最终延伸反应为72°C lOmin，引物1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3'，引物2 : 5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' ，引物2的5'端生物素标记。
[0027] (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过15轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目 标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:1，命名为GHbl。
[0028] 本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍 生物：将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、 二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的 骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适 体改造成的锁核酸。
[0029] 实施例2糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb2的制备 (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为3X 105的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3tr45-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列Ν3(Γ45为3(Γ45个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将1. Oml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化 血红蛋白在偶联缓冲液（20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15MNaCl，ImMDTT，pH5. 5)中混合， 加入120ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混25小 时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血 红蛋白-微磁珠复合物。
[0030] (3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将5nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgC12, 5mM KC1, 1 mM CaC12, 0. 02% Tween 20, 1 mM DTT)，进行加热处理，90 °C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA 文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液 体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核 苷酸库在结合缓冲液中37°C温育40min，用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mM NaCl，10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白 结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓 冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。
[0031] (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷 酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行 分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； PCR 扩增工艺条件为：94°C 预变性 5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 12 个循环，最终延伸反应为72°C lOmin，引物1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3'，引物2 : 5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' ，引物2的5'端生物素标记。
[0032] (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过10轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目 标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:2,命名为GHb2。
[0033] 本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍 生物：将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、 二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的 骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适 体改造成的锁核酸。
[0034] 实施例3糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb3的制备 (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为IX 106的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N35~6(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列N35~6(l为35~60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将0. 5ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化 血红蛋白在偶联缓冲液（20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15MNaCl，ImMDTT，pH5. 5)中混合， 加入160ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混28小 时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血 红蛋白-微磁珠复合物。
[0035] (3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将3nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgC12, 5mM KC1, 1 mM CaC12, 0. 02% Tween 20, 1 mM DTT)，进行加热处理，90 °C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA 文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液 体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核 苷酸库在结合缓冲液中37°C温育20min，用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mM NaCl，10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白 结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓 冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。
[0036] (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷 酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行 分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； PCR 扩增工艺条件为：94°C 预变性 5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 18 个循环，最终延伸反应为72°C lOmin，引物1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3'，引物2 : 5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' ，引物2的5'端生物素标记。
[0037] (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目 标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID NO:3,命名为GHb3。
[0038] 本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍 生物：将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、 二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的 骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适 体改造成的锁核酸。
[0039] 实施例4糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb4的制备 (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为7X 105的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3cr5(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列Ν3(Γ5(Ι为3(Γ50个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将0. 75ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化 血红蛋白在偶联缓冲液（20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15MNaCl，ImMDTT，pH5. 5)中混合， 加入200ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混30小 时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血 红蛋白-微磁珠复合物。
[0040] (3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将4nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液（100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgC12, 5mM KC1, 1 mM CaC12, 0. 02% Tween 20, 1 mM DTT)，进行加热处理，90 °C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA 文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液 体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核 苷酸库在结合缓冲液中37°C温育15min，用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH7.6，200 mM NaCl，10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白 结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓 冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。
[0041] (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷 酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行 分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； PCR 扩增工艺条件为：94°C 预变性 5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 20 个循环，最终延伸反应为72°C lOmin，引物1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3'，引物2 : 5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3'，引物 2 的 5' 端生物素标记。
[0042] (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过25轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目 标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:4,命名为GHb4。
[0043] 本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍 生物：将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、 二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的 骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适 体改造成的锁核酸。
[0044] 实施例5酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHbl、GHb2、GHb3、GHb4与糖化 血红蛋白的结合能力 1)体外合成带有5'端生物素标记的糖化血红蛋白核酸适体。
[0045] 2)在96孔ELISA板上加入带有0. lmg/ml糖化血红蛋白和血红蛋白对照的包被 液（Na2C03 15mM，NaHC03 35mM，NaCl 0. 2M)，每孔 lOOyL，设定 PBS 孔为调零孔，4°C孵育过 夜。
[0046] 3)用磷酸洗脱液洗涤ELISA板，然后封闭液包被96孔ELISA板，每孔100 μ L，37 °C封闭1小时后用洗脱液（PBS pH 7. 4，0. 05% Tween)洗涤。
[0047] 4)将生物素标记的核酸适体用磷酸缓冲液进行梯度稀释，浓度分别为0 nml/L，5 nml/L, 10nml/L，20nml/L, 50nml/L, 100nml/L，200 nml/L,将 100yL 稀释的核酸 适体非别接入包被有糖化血红蛋白和血红蛋白的96孔ELISA板中，25°C孵育30min。
[0048] 5)用洗脱液洗脱ELISA板后，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素用PBS按1 : 1000稀释后每孔加入100yL，37°C孵育30min。
[0049] 6)用洗脱液洗涤ELISA板，然后每孔加入辣根过氧化物酶显色底物TMB (3,3'，5,5，-tetramethybenzidine) 80μ? 显色 2min,终止反应后在 0D 值为 450 nm波长 下检测吸光度。
[0050] 7)使用Sigma plot软件作图，计算出所筛选到的核酸适体与糖化血红蛋白相互作 用的解离常数（kd)。
[0051] 检测到的核酸适体6他1、6他2、6他3、6他4与糖化血红蛋白的结合能力如图1~4所 /_J、1 〇
【权利要求】
1. 一种糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列为有SEQ ID N0:4中所示DNA片段序列，其序列为： SEQ ID NO:4：gggaggcatg ggaaacaatg cgccgcagag ttggaaccc〇
2. -种制备权利要求1任一所述糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为105~106的单链 DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为： 5 ' -GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3 ' 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(l和两端固定 序列，所述中间随机序列N25~6(l为25~60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为： 5' -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3' -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增 引物结合区； (2) 制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将有活化氨基的微磁珠与糖化血红蛋白按照 0. 05~0. 2ml: lmg的比例在偶联缓冲液中混合，再加入10(T200ul偶联剂溶液，25° C反应条 件下轻混2(Γ30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液 洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物； (3) 初次筛选靶物质-核酸复合物：将2~5nmol单链DNA随机序列寡核苷酸库溶于结 合缓冲液，进行加热处理，单链DNA文库与没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结 合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后 收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育15~40min，用洗脱缓冲 液洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异 结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92° C孵育 5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液； (4) 制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗 脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解 链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； (5) 筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经 过12~20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目 标寡核酸序列，通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与糖化血红蛋白结合的特异性和亲 和力。
3. 根据权利要求2所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于：所述 的PCR扩增用到的PCR引物序列为： 引物 1 :5' -ATACCAGCTTATTCAATT-3' 引物 2 :5' -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3' 所述的PCR扩增引物2的5'端含生物素标记； 所述PCR扩增工艺条件为：94°C预变性5 min，94°C 30s，47°C lmin，72°C lmin,扩增 1(T25个循环，最终延伸反应为72°C lOmin。
4. 根据权利要求2所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体的方法，所述的偶联缓冲液 为含20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl，ImM DTT，pH 5. 5 ;所述偶联剂溶液为含57%的二 甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述结合缓冲液为含100 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 7. 6， 2 mM MgCl2, 5mM KC1, 1 mM CaCl2,0. 02% Tween 20, 1 mM DTT ;所述热处理为 90 ° C加热 lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min;所述洗脱缓冲液为含20 mM Tris-HCl pH7. 6， 200 mM NaCl，10 mM EDTA。
5. 根据权利要求1中任一所述的糖化血红蛋白核酸适体或者权利要求2~4所述方法制 备得到的糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体用于识别、检测糖化血红蛋 白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒。
6. -种权利要求1中任一所述糖化血红蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下 四种中的任意一种： (1) 将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基 化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2) 权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3) 权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4) 权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。
7. -种权利要求2~4中任一所述制备得到的糖化血红蛋白核酸适体的衍生物，所述衍 生物包括以下四种中的任意一种： (1) 将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基 化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2) 权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3) 权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4) 权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。
8. 根据权利要求6或7所述的一种糖化血红蛋白核酸适体衍生物，其特征在于，所述的 核酸适体或者其衍生物用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的 试剂盒。
【文档编号】C12N15/10GK104109675SQ201410263912
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2012年11月14日
【发明者】李寿东, 胡建红, 李戈强, 李朝君, 谢志峰, 李朝志 申请人:广西安仁欣生物科技有限公司