一种嵌合载体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种嵌合载体，是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。本研究通过设计并构建RBD-Vif-C载体，然后通过细胞水平的体外实验和裸鼠肿瘤模型的体内实验证明RBD-Vif-C载体具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，提出了一种特异性针对突变型KRAS的新型抗肿瘤技术。Vif-C载体在降解KRAS蛋白中的成功应用，使其有望成为一种新型的基因敲除手段。作用虽类似于siRNA，但却优越于siRNA的功能。Vif-C载体可以特异性地降解靶标蛋白，尤其是一些处于某种特殊修饰或特殊状态下的蛋白。
【专利说明】一种嵌合载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白抗癌药物，更具体地，涉及一种嵌合载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]一直以来，控制细胞生长分化中的表达或功能的细胞基因组中如果发生改变都被认为是诱发肿瘤的主要原因。肿瘤的分子生物学研究旨在确定那些在各种肿瘤类型的基因改变，并阐明这些基因在肿瘤发生中的作用。其中，最常见的人类肿瘤突变的基因家族之一就是RAS基因。
[0003]正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效应是受控的。然而，突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。RAS基因就像体内的一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用。正常的KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。因为KRAS基因突变一般发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致；一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。因此，检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后和放化疗疗效的重要指标，具有极其重要的临床意义。
[0004]在我国，胰腺癌一直以来都是我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一，5年生存率不到5%，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，在广东地区，大肠癌已经成为第二大癌症杀手，有明显增加的趋势，其发病率和死亡率也明显逐年上升。肿瘤细胞RAS基因突变率大约为25%，而胰腺癌，结肠癌和非小肺泡肺癌中分别达到90%，45%和35%。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一提供一种嵌合载体是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的沿/蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。
[0006]本发明另外给出一种嵌合载体的制备方法，包括以下步骤:
S1.Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C ；
S2.将嵌合载体克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，
S3.从公司合成跨膜肽片段PTD，然后将其连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上
S4.以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet_32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C
S5.将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，
S6.对转化的大肠杆菌进行培养，S7.经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中，S6中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37 °C预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至0D600达0.6 ;表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,经诱导后收集菌体，
S7中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
[0007]本发明提供一种上述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0008]所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤。
[0009]本发明另外提出一种上述的嵌合载体在制备降解突变KRAS的药物中的应用。
[0010]Vif蛋白是HIV-1自身的一个重要蛋白，可以结合靶标蛋白，把它们连结到一个E3连接酶(Iigase)复合物(Vif-SCF_CUL5 complex)上,然后这个复合物将使祀标蛋白泛素化，从而导致其在proteasome (蛋白酶体)中的降解。本发明重点关注KRAS突变引发的相关癌症，试图将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的结合结构域RBD替换Vif的N端,通过体内体外等多种试验探索此嵌合型蛋白降解突变型KRAS的效率和作用机理。这一技术发明对进一步研发抗肿瘤的蛋白类药物具有十分重要的意义。因此，我们提出的这种新的构建嵌合蛋白的方法，将极有可能成为一种新的抗肿瘤的新技术，具有极为重要的学术价值和实用价值。
[0011]( I)为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种新型的嵌合载体的构建的方法及其在生命科学研究及肿瘤的临床治疗中的应用。
[0012](2)本发明提供了一种全新的KRAS基因相关的肿瘤杀伤技术。
[0013](3 )本发明提出了一种降解KRAS蛋白表达的新技术。
[0014](4)本发明提出了一种全新的在蛋白水平上可以特异性降解特殊状态或者特殊修饰的蛋白的新技术。
[0015](5)本发明提出了一种新的降解多种蛋白的新手段——将某种蛋白的结合为点插入到Vif基因的N端，从而通过Vif C端的泛素化通路实现特异性蛋白的降解过程。
[0016](6)本发明提供了一种新的技术在治疗胰腺癌肿瘤中的应用。
[0017](7)本发明提供了一种新的技术在治疗大肠癌(结直肠癌)肿瘤中的应用。
[0018](8)本发明提供了一种新的技术在治疗肺癌肿瘤中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1:嵌合载体RBD-Vif-C的构建模型。
[0020]图2:嵌合载体RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，并抑制其下游磷酸化信号通路。
[0021]图3:PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用。
[0022]图4:PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果。
[0023]图5:PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0025]实施例1嵌合载体RBD-Vif-C的构建模型
众所周知，胰腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤的发生与KRAS基因的突变有莫大的关联。KRAS的单个点突变就足以导致肿瘤的发生，其中KRAS的第12位氨基酸的突变占了 KRAS单点突变的98%，而在这第12位氨基酸的突变种类中又分别抑G12V和G12D突变最为显著，分别占了 30%和51%。我们利用Vif诱导靶蛋白的降解机制实现对突变型KRAS蛋白的特异性降解，从而研发新型的抗肿瘤的药物。
[0026]根据查阅文献了解到，RAF-1蛋白的N-端存在一个特异性结合突变型KRAS的结合结构域RBD(KRAS binding domain)，它在体内体外都可以特异地结合突变型KRAS蛋白，其对GTP-Kras与⑶P-Kras结合的亲和力的差别达1000倍。于是，我们将RBD替换Vif蛋白的N端，然后连接到pcDNA3.1的载体上形成了 RBD-Vif-C嵌合载体。
[0027]具体方法如下:
(1)Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C
(2)将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达
(3)从公司合成跨膜肽片段PTD，然后将其连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上 (4)以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet_32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C
(5)将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中
(6)对转化的大肠杆菌进行培养
(7)经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白
其中，步骤(1)中，所述的载体构建包括以下步骤:根据HIV-1的Vif蛋白和KRAS蛋白分别合成2对引物，然后以HIV-1病毒的PNL4-3质粒序列为模板，利用上述引物进行PCR扩增；然后利用不同的酶切位点将PCR扩增产物克隆到pcDNA3.1上，其中RBD的片段插入位置在Vif片段的N端。
[0028]步骤(6)中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37 °C预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至0D600达0.6 ;表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,经诱导后收集菌体。
[0029]步骤(7)中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
[0030]实施例2嵌合载体RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，并抑制其下游磷酸化信号通路
将突变型的KRAS基因KRAS-G12D和KRAS-G12V分别与RFP基因融合表达并克隆到pcDNA3.1的载体上，这样可以通过观察RFP的表达来反映KRAS的表达情况；同时用western blot来进一步验证KRAS的表达情况。
[0031 ] (I)在6孔板的293t细胞中，共转染KRAS-G12D-RFP和RBD-Vif-C载体或KRAS-G12V-RFP和RBD-Vif-C载体，质粒的量均为I ug，转染48h后观察RFP的表达；同时收细胞裂解做Western Blot检测KRAS的表达该实验说明了，RBD-Vif-C可以降解突变型的KRAS蛋白。
[0032](2)在6孔板的293t细胞中转染KRAS-G12D和RBD-Vif-C质粒，48h后收细胞裂解做Western Blot检测ERK及磷酸化的ERK的表达情况
该实验说明了，RBD-Vif-C可以通过降解KRAS蛋白来抑制其下游的磷酸化的信号通路。
[0033]实施例3 PTD-RBD-Vif-C蛋白在体外具有良好的肿瘤细胞杀伤作用
考虑到胰腺癌、肺癌和大肠癌细胞质粒系统转染效率低等因素，以及后续的蛋白成药性因素，于是，我们选择用大肠杆菌来表达相应的RBD-Vif-C蛋白，同时选择GFP-Vif-C作为阴性对照蛋白，试图直接通过蛋白的作用方式来验证RBD-Vif-C对KRAS基因的表达抑制。
[0034]我们首先参考相关文献的方法，合成了一个可以高效跨膜的短肽PTD，序列如图所示。然后，我们将跨膜肽和RBD-Vif-C —起克隆到pET-32a原核表达载体上，通过原核系统表达RBD-Vif-C蛋白。我们采用镍柱纯化带His-tag的PTD-RBD-Vif-C蛋白，通过多番优化后得到纯度相对较高的蛋白。然后，我们又进一步通过TritonX-114的方法去除蛋白中的内毒素。因为蛋白本身具有跨膜肽，所以我们可以直接将纯化好的蛋白加入到细胞培养上清中，这为我们后续的实验提供了较大的便利。
[0035](I)将多种细胞铺板到24孔板中，待细胞贴壁后，分别加入4ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白或PTD -GFP-Vif-C蛋白，处理48h后，显微镜下观察并记录各种细胞的生长状态。
[0036]该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制多种KRAS相关的肿瘤细胞的增殖。
[0037](2)在 24 孔板的 Panc-1 和 A549 细胞中，分别加入 O ug/well, 2 ug/well ,4 ug/well ,8 ug/well 的 PTD-RBD-Vif-C 蛋白，处理 48h 后，收集细胞,标记 Annexin-V FITC 的流式抗体,检测两种细胞的凋亡情况。
[0038]该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以诱导KRAS相关的肿瘤细胞发生凋亡，并具有一定的浓度梯度依赖性。
[0039](3)在 6 孔板的 Panc-1 和 A549 细胞中，分别加入 2 ug/well 的 PTD-GFP-Vif-C蛋白和2 ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白，处理12h后，收集细胞裂解做WB检测两种细胞内源性的KRAS的表达情况；
该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制内源性的KRAS基因表达。
[0040]实施例4 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果
在中山大学动物实验中心订购4-6周大小的雄性Balb/c裸鼠6只。随机的将他们分成2组，每组3只。然后分别将I X 106的Panc-1和A549细胞接种到小鼠皮下成瘤，2周后观察小鼠皮下成瘤的现象并开始每周注射2-3次PTD-RBD-Vif-C蛋白和PTD-GFP-Vif-C蛋白，4周后处死小鼠取肿瘤组织观察并记录称重。
[0041]该实验说明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内具有良好的抗肿瘤效果，尤其是在胰腺癌和肺癌的肿瘤细胞中。
[0042]实施例5 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠体内的急毒实验
(I)在中山大学动物实验中心订购4-6周大小的雄性Balb/c小鼠18只。随机的将他们分成3组，每组6只；(2)以尾静脉注射的方式将PTD-RBD-Vif-C蛋白注入小鼠体内，注射量分别为Omg/kg (PBS)，10mg/kg, 20mg/kg,每组 6 只小鼠；
(3)两周后，取小鼠血样检测肝功能和肾功能，实验结果显示正常；
(4)处死后，取小鼠心肝脾肺肾各个组织样本，HE染色，观测是否有器官发生病变。
[0043] 该实验说明了，20mg/kg剂量的蛋白对小鼠是无毒安全的，该蛋白具有较好的成药性。
【权利要求】
1.一种嵌合载体，其特征在于，是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的/fe/蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。
2.一种嵌合载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: S1.Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C ； S2.将嵌合载体克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达， S3.将跨膜肽片段PTD连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上， S4.以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet_32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C, S5.将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中， S6.对转化的大肠杆菌进行培养， S7.经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白， 其中，S6中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37 °C预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至0D600达0.6 ;表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,经诱导后收集菌体， S7中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的融合表达载体PTD-RBD-Vif-C的序列如SEQ NO:1所示，从N端到C端的结构分别为，跨膜肽PTD部分，RBD的Kras结合部位，Vif-C的降解部分。
4.一种根据权利要求1所述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤等KRAS相关的肿瘤。
6.一种根据权利要求1所述的嵌合载体在制备降解突变KRAS的药物中的应用。
【文档编号】C12N15/64GK104131034SQ201410275218
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】张辉, 潘婷 申请人:中山大学