一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，属于酶化学【技术领域】。本发明以高碘酸钠为氧化剂，氧化处理多糖制备氧化多糖，再以氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析和冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。在pH?7.63，反应时间15.53h，还原剂浓度0.2mol/L，葡聚糖浓度0.3％的条件下修饰后，米根霉脂肪酶活性提高2.2倍。同时，50℃处理30min后，相对于未修饰脂肪酶，修饰后的脂肪酶稳定性提高78％。本发明具有成本低，安全无毒，兼顾脂肪酶活性和稳定性的特点，适于产业化推广应用。
【专利说明】一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，属于酶化学【技术领域】。 技术背景
[0002] 米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase,R0L)是由丝状真菌产生的一种具有严格 1，3位置特异性和对中长链底物专一性的脂肪酶。一般野生型的米根霉菌种脂肪酶活性较 低，需经过进一步的基因克隆与表达方可获得高效脂肪酶。
[0003] 在对脂肪酶催化活性，稳定性，选择性等方面的研究中发现，从自然界中筛选到的 产脂肪酶野生菌株，它的表达产量受宿主菌基因的严格调控，只能达到满足微生物自身代 谢，而不能达到市场高效表达提高产量的要求。现有的酶性能改性技术主要包括固定化、化 学修饰、体外定向进化、生物印记及蛋白质工程的定点突变技术。在众多方法中，化学修饰 可以在不知酶蛋白结构的情况下，允许大范围的化学基团快速的引入到酶的结构中，使酶 蛋白折叠构象发生改变，继而改变酶结构及催化性能。化学修饰方法又可以分为交联酶晶 体、酶蛋白侧链功能基共价修饰、酶蛋白表面修饰、结合定点突变的化学修饰、通过酶活性 位点氨基酸原子置换进行化学突变等方法。
[0004] 然而，在现有的酶化学修饰中，在改变脂肪酶活性的同时，也会使酶的稳定性受到 很大的影响，很难达到活性和稳定性的同时提高。选择多糖作为修饰剂对脂肪酶进行化学 修饰，可以同时提高脂肪酶活性和稳定性，具有很好应用潜力。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法。利 用氧化多糖对米根霉脂肪酶进行化学修饰，同时提高了酶活和稳定性，具有很高的应用推 广价值。本发明所采取的技术方案如下：
[0006] -种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，是以高碘酸钠为氧化剂，氧化处理 多糖制备氧化多糖，再以氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析和冻干 后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。
[0007] 所述方法的步骤如下：
[0008] 1)将多糖配成浓度为10mg/mL的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为 50mmol/L,黑暗下反应2h后再于4°C黑暗下反应24h,反应完后加入乙二醇终止反应，获得 氧化多糖溶液；
[0009] 2)向pH7. 6的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1)所得的氧化多糖溶液， 混合均匀后获得混合溶液，20°C下反应15. 5h ;
[0010] 3)向反应完的步骤2)中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为0. 2mol/L，于 20°C下反应lh后获得多糖修饰溶液；
[0011] 4)利用透析袋透析步骤3)所得多糖修饰溶液，冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪 酶。
[0012] 所述方法步骤1)中所述多糖为葡聚糖、聚蔗糖或菊糖。
[0013] 所述方法中所述葡聚糖的分子量为20KDa或200KDa，所述聚蔗糖的分子量为 70KDa或400KDa，所述菊糖的分子量为5KDa。
[0014] 所述方法中步骤2)中所述混合溶液氧化多糖的浓度为0. 3%。
[0015] 所述方法中步骤4)所述透析袋，分子截留量为3500Da。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)将分子量200KDa的葡聚糖配制成浓度为10mg/mL的溶液，并在溶液中加入高碘 酸钠至其浓度为50mmol/L,20°C下反应24h,反应完毕后加入乙二醇终止反应，获得氧化葡 聚糖溶液；
[0018] 2)向pH7. 6的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1)所得的氧化葡聚糖溶 液，混合均匀后获得混合溶液，20°C下反应15. 5h ;
[0019] 3)向反应完的步骤2)中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为0.2mol/L，于 20°C下反应lh后获得葡聚糖修饰溶液；
[0020] 4)利用分子截留量3500Da的透析袋透析步骤3)所得葡聚糖修饰溶液，冻干后获 得葡聚糖修饰米根霉脂肪酶。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 1.本发明针对天然米根霉脂肪酶的催化活性低及稳定性差的问题，利用大分子多 糖对米根霉脂肪酶进行修饰，使修饰后酶的催化活性提高，稳定性也显著提高。克服了现 有技术中不能实现酶活性与酶稳定性同时提高的技术缺陷，使米根霉脂肪酶的性能显著提 高，更适用于工业化应用。
[0023] 2.本发明确定了修饰酶反应的最佳工艺条件：在pH 7. 63、时间15. 53h、还原剂浓 度为0. 20mol/L、葡聚糖浓度为0. 30%，米根霉脂肪酶活性提高了 2. 2倍。
[0024] 3.本发明中采用的修饰剂安全，无毒，对修饰酶应用于食品加工行业，提供了较高 的安全性。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为反应时间对修饰酶活性的影响。
[0026] 图2为pH对修饰酶活性的影响。
[0027] 图3为还原剂浓度对修饰酶活性的影响。
[0028] 图4为葡聚糖浓度对修饰酶活性的影响。
[0029] 图5为不同修饰反应因素响应面趋势图；
[0030] (a. pH和时间对酸解活性影响的曲面图；b. pH和还原剂浓度对酸解活性影响的曲 面图；c.时间和葡聚糖浓度对酸解活性影响的曲面图）。
[0031] 图6为原酶和修饰酶的最适作用温度。
[0032] 图7为温度对原酶和修饰酶活性的影响。
[0033] 图8为pH对原酶和修饰酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0034] 本发明针对米根霉脂肪酶的催化活性低及稳定性差的问题，利用氧化多糖对米根 霉脂肪酶进行修饰，修饰后酶的活性和稳定性同时显著提高。所用修饰剂安全无毒，更适用 于工业化应用。下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0035] 实施例1氧化多糖修饰米根霉脂肪酶的制备与检测
[0036] 1.多糖的氧化
[0037] 将多糖溶解为10mg/mL溶液后，向溶液中加入高碘酸钠使其浓度为50mmol/L。将 上述体系在室温黑暗下反应2h后再于4°C黑暗下反应24h，最后加入500 μ L的乙二醇混匀 以终止反应。lh后，将产物透析处理后，得到多糖氧化物，分装为lmL于4°C冰箱中储存。
[0038] 2.脂肪酶的化学修饰
[0039] 称取 20mg R0L 在 2mL pH6-8 磷酸盐（0· 02mol/L Na2HP04/NaH2P04)缓冲液中溶解。 将一定体积的多糖氧化物加入到酶溶液中，混合均匀后，在室温下培养8?48h后，加入不 同浓度的硼氢化钠，不断搅拌混匀，lh后将样品经透析处理移去溶剂，再经冻干，得到多糖 修饰的米根霉脂肪酶。
[0040] 3.脂肪酶酸解方法
[0041] 将猪油和辛酸以3:1的比例放于5mL离心管中，振荡混匀后放于40°C水浴锅中， 再加入底物质量5%的脂肪酶催化酸解反应，两个小时后取出离心管，9000r/min下离心 5min。吸取上层油相保存于4°C冰箱，待分析。
[0042] 4.薄层色谱分离
[0043] 分离条件：硅胶板G板；展开剂：V(石油醚-乙醚-乙酸）= 80/20/2。板子浸 入展开剂的深度距离板子底边0.5?1.0cm。展开完成后，取出板子晾干，均匀喷洒0. 1% 2, 7-二氯荧光素显色。甘油脂肪酸分离后，各组分的保留参数（Rf值）分别为：固醇Rf = 0· 81，甘三酯 Rf = (λ 69,1，3-甘二酯 Rf = (λ 31，1，2-甘二酯 Rf = (λ 22,甘一酯 Rf = (λ 02， 脂肪酸Rf = 0.50。
[0044] 5.甲酯化方法
[0045] 将薄层分离后的甘三酯和甘二酯置于25mL圆底烧瓶，加入2mL0. 5mol/L的 K0H-甲醇溶液振荡混勻，在70°C水浴中反应lOmin，取出冷却后，加入即时配制的BF3-甲醇 溶液3mL[V(BF3-乙醚）：V(甲醇）=1:3]，再于70°C水浴回流反应5min，取出冷却，加入 2mL正己烷充分振荡，使样品完全萃取于正己烷中，再加入饱和氯化钠溶液，静置5min后， 吸取上层正己烷于样品瓶中保存。
[0046] 6.气相色谱测定条件
[0047] 实验分析采用安捷伦7890气相色谱仪和氢火焰离子检测器（FID)。色谱柱： FFAP(100mX0. 25mmX0. 20μπι);燃气：H2,流量 30mL/min ;助燃气：空气，流量 300mL/ min ;载气：He，流量lmL/min ;柱前压：37. 5MPa ;分流比50:1 ;进样量lyL ;进样口温度： 240°C ;炉温：140°C，维持5min ;检测器温度：250°C。使用安捷伦化学工作站（HP3398A GChemStation)进行数据采集分析，采用面积归一化法计算。
[0048] 7.酶活性定义
[0049] 酸解反应是甘油三酯在脂肪酶的催化下与脂肪酸之间发生酰基转移从而改变甘 油三酯结构组成的方法。以猪油和辛酸为底物，通过测定辛酸在甘油三酯上的结合率，来反 映脂肪酶的酸解活性。
[0050] = "--ΖΓ7~?Γ7^--" X 10-1? ^fcS麗
[0051] 实施例2葡聚糖（Dextran)对米根霉脂肪酶化学修饰的优化
[0052] 1.单因素实验
[0053] 采用葡聚糖20万作为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，以反应时间8?48h、 反应pH6?8、还原剂浓度0.05%?0.4%和葡聚糖浓度0. 1%?1%为主要影响因素，分别 对其进行单因素实验，考察各因素对酶修饰效果影响。
[0054] 图1为当反应pH为7. 5,还原剂浓度为0.2mol/L，葡聚糖浓度为0.5%时，反应时 间对修饰酶活性的影响。从图2中可知，当反应时间小于16h时，酶活性随时间的延长而升 高，在16h时达到最高点，后又随时间降低。所以后续优化实验时，反应时间的中心值选择 在16h附近。
[0055] 图2为当反应时间为20h，还原剂浓度为0. 2mol/L，葡聚糖浓度为0. 5%时，反应 pH对修饰酶活性的影响。从图2中可知，酶在酸性条件下修饰后，活性较低，随pH升高有显 著提高，在pH为7.6时达到最高，随后又快速降低。
[0056] 图3为当反应时间为20h，反应pH为7. 5,葡聚糖浓度为0. 5%时，还原剂浓度对修 饰酶活性的影响。从图3中可知，酶活性随还原剂浓度先升高后缓慢降低，在0. 2mol/L时 达到最高点。所以后续优化实验中，还原剂浓度的中心值选择在〇. 2mol/L附近。
[0057] 图4为当反应时间为20h，反应pH为7. 5,还原剂浓度为0. 2mol/L时，葡聚糖浓度 对修饰酶活性的影响。从图4中可知，酶活性随葡聚糖浓度先升高后降低，在0. 30%时达到 最高点。所以后续优化实验中，还原剂浓度的中心值选择在〇. 30%附近。
[0058] 2.响应面优化
[0059] 根据响应面实验设计原理，在上述单因素实验的基础上，设计四因素三水平的响 应面实验共计29个。以反应时间、反应pH、还原剂浓度和葡聚糖浓度为自变量，以酸解活性 为响应值，建立二次多项式回归模型，实验设计因素及编码水平见表1。
[0060] 表1实验设计因素及编码水平
【权利要求】
1. 一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，其特征在于，以高碘酸钠为氧化剂，氧 化处理多糖制备氧化多糖，再以氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析 和冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 将多糖配成浓度为10mg/mL的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为50mmol/ L，20°C黑暗下反应2h后再于4°C黑暗下反应24h，反应完后加入乙二醇终止反应，获得氧化 多糖溶液； 2) 向pH7. 6的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1)所得的氧化多糖溶液，混合 均匀后获得混合溶液，20°C下反应15. 5h ; 3) 向反应完的步骤2)中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为0. 2mol/L，于20°C下 反应lh后获得多糖修饰溶液； 4) 利用透析袋透析步骤3)所得多糖修饰溶液，冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述多糖为葡聚糖、聚蔗糖或菊糖。
4. 权利要求3所述方法，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为20KDa或200KDa，所述聚 蔗糖的分子量为70KDa或400KDa，所述菊糖的分子量为5KDa。
5. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述混合溶液氧化多糖的浓度为 0· 3%。
6. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述透析袋，分子截留量为3500Da。
7. 权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 将分子量200KDa的葡聚糖配制成浓度为10mg/mL的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠 至其浓度为50mmol/L，20°C下反应24h，反应完毕后加入乙二醇终止反应，获得氧化葡聚糖 溶液； 2) 向pH7. 6的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1)所得的氧化葡聚糖溶液，混 合均匀后获得混合溶液，20°C下反应15. 5h ; 3) 向反应完毕的步骤2)中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为0. 2mol/L，于20°C 下反应lh后获得葡聚糖修饰溶液； 4) 利用分子截留量3500Da的透析袋透析步骤3)所得葡聚糖修饰溶液，冻干后获得葡 聚糖修饰米根霉脂肪酶。
【文档编号】C12N9/20GK104046602SQ201410288942
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】刘宁, 李春, 武玉婷 申请人:东北农业大学