一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法
【专利摘要】一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，它涉及一种制备正丁醇的方法。本发明要解决现有生物发酵生产正丁醇过程中底物成本高，木质纤维素水解过程中商品酶的应用造成成本上升，以及单一菌种纤维素酶系比例失衡造成的酶活降低等问题。方法：将预处理木质纤维素应用源于绿色木霉和黑曲霉纤维素酶混合粗酶液进行生物酶法水解，得到的糖液加入氮源、无机盐和维生素后通入氮气除氧，接种丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵生产正丁醇。本发明提高了纤维素酶解过程中生物酶的活性，降低了生物发酵生产正丁醇过程中底物和酶法水解的成本消耗，减少了设备损耗和环境污染问题；本发明中混合粗酶液糖化水解效率达到75％。
【专利说明】一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵生产正丁醇的方法。
【背景技术】
[0002]目前，世界能源需求主要由化石燃料满足。然而，化石燃料资源枯竭一直是困扰人类社会可持续发展的一大重要因素，随着科技的发展，人类越来越依赖能源来开展生产生活活动，这种影响近年来尤为明显，对有限的能源资源的需求与日俱增，因此，开发一种新型能源势在必行。正丁醇作为一种新型能源载体，其与汽油互溶性好，并可直接应用于现有发动机，具有较高的能量密度，辛烷值接近汽油，且亲水性较差，便于运输等优点，被称为新一代生物能源。生产正丁醇的方法有很多种，石油加工法目前应用最广、成本也较低，但是其受制于石油资源的枯竭具有不可持续性；而生物发酵法生产正丁醇技术以其可持续性和发酵过程节能环保，受到广泛的关注。为了使生物发酵生产正丁醇更具经济竞争力，寻求一种可再生且廉价的基质是关键。木质纤维素原料，如农业废弃物，是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一。亚洲国家具有巨大的利用农业废弃物生物发酵生产正丁醇的潜力，仅我国每年农业废弃物(玉米秸杆、稻草和麦秸等)的产量可达7亿吨左右，能量相当于5亿吨标煤。如果能将这些生物质资源有效利用起来，有目的性地降解，并进一步转化为丁醇，这将极大的降低生产 丁醇的成本，使大规模并产业化生产燃油丁醇成为可能，这将在一定程度上缓解当前紧张的能源短缺局面。
[0003]由于秸杆表层蜡质的保护作用、木质素和半纤维素的空间障碍效应以及纤维素的高结晶度和聚合度影响秸杆的生物转化效率。因此，要充分有效利用农作物秸杆资源，就必须对秸杆进行预处理，破坏秸杆的表层蜡质、木质素-半纤维素的共价结合、纤维素的结晶结构等，使纤维素与木质素及半纤维素相互分离，增加纤维素分子与微生物或酶的接触概率，实现提高秸杆生物转化效率的目的。生物酶法水解因其反应条件温和、酶促反应的特异性与高效性受到青睐。但是在生物酶法水解的过程中所用的纤维素商品酶制备过程复杂、保存条件严格、价格较高，会进一步提高生物发酵生产正丁醇的成本。
[0004]生物酶法降解木质纤维素是一个酶系各组分相互协同作用最后达到降解效果的过程:内切葡聚糖酶能够附着在纤维丝表面切断纤维素的分子链，外切葡聚糖酶则在纤维素分子链两端进行切割形成葡萄糖或纤维二糖，最后β -1, 4-葡萄糖苷酶能够将纤维二糖分解形成葡萄糖。在这一过程中各种酶相互协调的效果取决于各组分的酶活力以及该组分在整体酶系中的比例。而由于不同菌种中纤维素酶系各组分表达的差异性，在纤维素酶系的生产过程中往往几种酶的活力及产量配比是无法协调发挥最大效率的。如常见的纤维素酶生产菌株绿色木霉，其纤维素酶系中β -1, 4-葡萄糖苷酶活性较低，结果会造成在其纤维素水解产物中纤维二糖的大量积累，这不但会降低其纤维素的降解效率，更对接下来水解液的进一步发酵应用产生不利影响；再如另一常见纤维素降解真菌黑曲霉中，若仅仅β-1，4-葡萄糖苷酶具有较高酶活，但其内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活力不足以降解纤维素产生足够的纤维二糖，对黑曲霉降解纤维素的整体效率没有帮助。因此多种菌株纤维素酶的混合粗酶液水解纤维素能够明显改善整体纤维素酶系中各组分酶的协调比例，最终提高整体的纤维素降解能力，有利于降低纤维素发酵生产正丁醇的生产成本。但目前没有一组有效的多种菌株有效生产正丁醇的方案。
【发明内容】
[0005]本发明要解决现有生物发酵生产正丁醇过程中底物成本高，木质纤维素水解过程中商品酶的应用造成成本上升，以及单一菌种纤维素酶系比例失衡造成的酶活降低等问题。从而提供一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法。
[0006]本发明的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，是按以下步骤实现:
[0007]—、对木质纤维素采用碱预处理:木质纤维素与质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液按质量比为1:9的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100°C条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至PH为中性并在105°C条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素；
[0008]二、混合粗酶液的获得:将绿色木霉和黑曲霉分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为2~4:1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液； [0009]其中，液体发酵的具体操作如下:分别绿色木霉孢子和黑曲霉孢子接种到绿色木霉的液体产酶培养基和黑曲霉的液体产酶培养基中，然后在好氧发酵温度为28~32°C、转速为80~120r/min的条件下振荡培养4~6d,发酵过程结束后发酵液分别以5000g离心15min，分别收集上清液，所得上清液分别为绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；
[0010]三、将步骤一得到的预处理的木质纤维素按质量体积比为0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步骤二得到的混合纤维素酶粗酶液中，在水解体系pH值4.0~5.5、温度为50~600C的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48~60h，然后经5000g离心15min，取上清液后浓缩，再加入厌氧培养基中并通入氮气除氧，再接入丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵96h，即完成利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇；
[0011]其中，步骤二中所述的所述绿色木霉的孢子接种量为IO8~IO9个/L，所述的绿色木霉的液体产酶培养基含有浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4.7H20溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的尿素溶液、浓度为20g/L的麸皮溶液、浓度为8g/L的玉米秸杆溶液、浓度为5g/L的豆饼粉溶液以及微量金属元素贮液lmL/L ;所述的微量金属元素贮液母液含有浓度为5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.6g/L的MgSO4溶液、浓度为1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及浓度为2.0g/L的CoCl2溶液；
[0012]步骤二中所述的黑曲霉的孢子接种量为IO12~IO16个/L ;所述的黑曲霉的液体产酶培养基含有浓度为1.0g/L的麸皮溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4溶液、浓度为1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和浓度为2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0013]步骤三中所述的厌氧培养基中含有浓度为2.0g/L的酵母粉溶液、浓度为2.5g/L的KH2PO4溶液、浓度为3.0g/L的Na2HPO4溶液、浓度为1.0g/L的NH4Cl溶液、浓度为0.4g/L的MgSO4溶液、浓度为0.5g/L的半胱氨酸溶液、维生素储液lmL/L、微量金属元素储液ImL/L以及浓度为0.05g/L的刃天青溶液；所述维生素贮液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B12和100.0mg的盐酸吡哆醇组成；所述微量金属元素储液每 IL 由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、
0.19g 的 CoCl2 *6H20,24mg 的 NiCl2 *6H20,36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2Η20 和 15mg的 Na2SeO4.5H20 组成；
[0014]步骤三中所述的丙酮丁醇梭菌，其种子液接种量是按体积百分含量为2%的生长至对数期、600nm条件下OD值为1.0的液体悬浊液。
[0015]本发明步骤三中丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824购买于中国普通微生物菌种保藏中心。
[0016]本发明中所用的绿色木霉为绿色木霉T.viride AS3.3711是具有较高的内切纤维素酶活力的菌株，购买自中国科学院微生物菌种保藏中心；本实施方式的黑曲霉为黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有较高β -1, 4-葡萄糖苷酶活性菌株并购买自中国普通微生物菌种保藏中心。
[0017]本发明具有以下有益效果:
[0018](I)木质纤维素的水解采用纤维素酶混合粗酶液降解法，黑曲霉ATCC 16888菌株所具有的高β -1, 4-葡萄糖苷酶活力弥补了绿色木霉AS3.3711中相应酶活力较低的短板，改善了混合粗酶液中纤维素酶系中各种组分协调作用的效果，混合粗酶液对预处理后的纤维素进行水解糖化，糖化率(糖化率指水解产糖量与纤维素中纤维素与半纤维素质量的比值)可以达到75%，与绿色木霉以及黑曲霉各自粗酶液进行酶解反应的糖化率相比较提高幅度分别为25%和30% ;
[0019](2)采用粗酶液生物转化法完成由木质纤维素到正丁醇的生产过程，降低设备损耗，减少了化学糖化过程中能源消耗和环境污染，降低了生物发酵生产正丁醇的成本，减少能源生产对化石燃料的依存度；
[0020](3)粗酶液降解木质纤维素的效率与商品酶比较后发现，前者能够达到后者的90%，说明粗酶液可以很好地替代价格昂贵的商品化纤维素酶对纤维素进行处理，从而进一步降低了酶法水解过程中的成本；
[0021](4)本发明采用的浓缩水解糖液的方法解决了木质纤维素酶法糖化水解液中单糖初始含量较低的问题，同时未发现有厌氧发酵抑制物的产生，分步糖化发酵生产正丁醇具有相对较高且稳定的产量，批式发酵生产正丁醇终浓度可达7.05g/L，正丁醇产率0.141g/gsubstrate。
【具体实施方式】
[0022]【具体实施方式】一:本实施方式应用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵生产正丁醇的方法按以下步骤实现:[0023]一、对木质纤维素采用碱预处理:木质纤维素与质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液按质量比为1:9的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100°C条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至PH为中性并在105°C条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素；
[0024]二、混合粗酶液的获得:将绿色木霉和黑曲霉分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为2~4:1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液；
[0025]其中，液体发酵的具体操作如下:分别绿色木霉孢子和黑曲霉孢子接种到绿色木霉的液体产酶培养基和黑曲霉的液体产酶培养基中，然后在好氧发酵温度为28~32°C、转速为80~120r/min的条件下振荡培养4~6d,发酵过程结束后发酵液分别以5000g离心15min，分别收集上清液，所得上清液分别为绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；
[0026]三、将步骤一得到的预处理的木质纤维素按质量体积比为0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步骤二得到的混合纤维素酶粗酶液中，在水解体系pH值4.0~5.5、温度为50~600C的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48~60h，然后经5000g离心15min，取上清液后浓缩，再加入厌氧培养基中并通入氮气除氧，再接入丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵96h，即完成利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇；
[0027]其中，步骤二中所述的所述绿色木霉的孢子接种量为IO8~IO9个/L，所述的绿色木霉的液体产酶培养基含有浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为0.3g/L 的MgSO4.7H20溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的尿素溶液、浓度为20g/L的麸皮溶液、浓度为8g/L的玉米秸杆溶液、浓度为5g/L的豆饼粉溶液以及微量金属元素贮液lmL/L ;所述的微量金属元素贮液母液含有浓度为5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.6g/L的MgSO4溶液、浓度为1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及浓度为2.0g/L的CoCl2溶液；
[0028]步骤二中所述的黑曲霉的孢子接种量为IO12~IO16个/L ;所述的黑曲霉的液体产酶培养基含有浓度为1.0g/L的麸皮溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4溶液、浓度为1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和浓度为2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0029]步骤三中所述的厌氧培养基中含有浓度为2.0g/L的酵母粉溶液、浓度为2.5g/L的KH2PO4溶液、浓度为3.0g/L的Na2HPO4溶液、浓度为1.0g/L的NH4Cl溶液、浓度为0.4g/L的MgSO4溶液、浓度为0.5g/L的半胱氨酸溶液、维生素储液lmL/L、微量金属元素储液ImL/L以及浓度为0.05g/L的刃天青溶液；所述维生素贮液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B12和100.0mg的盐酸吡哆醇组成；所述微量金属元素储液每 IL 由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、
0.19g 的 CoCl2 *6H20,24mg 的 NiCl2 *6H20,36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2Η20 和 15mg的 Na2SeO4.5H20 组成；
[0030]步骤三中所述的丙酮丁醇梭菌，其种子液接种量是按体积百分含量为2%的生长至对数期、600nm条件下OD值为1.0的液体悬浊液。
[0031]本实施方式步骤三中丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824购买于中国普通微生物菌种保藏中心。
[0032]本实施方式的绿色木霉为绿色木霉T.viride AS3.3711是具有较高的内切纤维素酶活力的菌株，购买自中国科学院微生物菌种保藏中心；本实施方式的黑曲霉为黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有较高β -1, 4-葡萄糖苷酶活性菌株并购买自中国普通微生物囷种保减中心。
[0033]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中所述的将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为3:1的比例混合。其它与【具体实施方式】一相同。
[0034]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:步骤三中所述的取上清液后浓缩是指采用减压蒸馏的方法浓缩至上清液2~4倍浓度。其它与【具体实施方式】一或二相同。
[0035]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤二中所述的在好氧发酵温度为28~32°C、转速为100~120r/min的条件下振荡培养4d。其它与
【具体实施方式】一至三之一相同。 [0036]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤三中所述的在水解体系pH值4.0~5.5、温度为55~60°C的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48h。其它与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0037]通过以下实验验证本发明的有益效果:
[0038]实验I
[0039]本实施方式的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，是按以下步骤实现:
[0040]一、对木质纤维素采用碱预处理:木质纤维素与质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液按质量比为l:9(w/w)的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100°C条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至PH为中性并在105°C条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素；
[0041]二、混合粗酶液的获得:将绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711和黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 16888分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为2~4:1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液；
[0042]其中，液体发酵的具体操作如下:分别绿色木霉孢子和黑曲霉孢子接种到绿色木霉的液体产酶培养基和黑曲霉的液体产酶培养基中，然后在好氧发酵温度为28~32°C、转速为80~120r/min的条件下振荡培养4~6d,发酵过程结束后发酵液分别以5000g离心15min，分别收集上清液，所得上清液分别为绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；
[0043]三、取32~60g步骤一预处理的木质纤维素加入到400mL步骤二得到的混合粗酶液中，在水解体系pH值4.0~5.5、温度为50~60 °C的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48h以上，之后经5000g离心条件下离心15min取得上清水解液，并将该上清液浓缩，之后加入氮源及盐溶液并通入氮气除氧，再接入丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) ATCC824种子液进行厌氧发酵96h生产正丁醇；
[0044]其中，步骤二中绿色木霉的液体产酶培养基中，所述绿色木霉的孢子接种量为IO8~IO9个/L ;绿色木霉T.viride AS3.3711购买自中国科学院微生物菌种保藏中心；所述的液体产酶培养基含有浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4.7Η20溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的尿素溶液、浓度为20g/L的麸皮溶液、浓度为8g/L的玉米秸杆溶液、浓度为5g/L的豆饼粉溶液以及微量金属元素贮液lmL/L ;所述的微量金属元素贮液母液含有浓度为5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.6g/L的MgSO4溶液、浓度为1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及浓度为2.0g/L的CoCl2溶液；
[0045]步骤二中黑曲霉的液体产酶培养基中，所述黑曲霉的孢子接种量为IO12~IO16个/L ;黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有较高β _1，4-葡萄糖苷酶活性菌株并购买自中国普通微生物菌种保藏中心；所述的产酶培养基含有浓度为1.0g/L的麸皮溶液、浓度为
1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为
0.3g/L 的 MgSO4 溶液、浓度为 1.6mg/L 的 FeSO4.7H20 溶液、浓度为 1.4mg/L 的 ZnSO4.7H20溶液和浓度为2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0046]步骤三中所述的厌氧发酵体系中，含有浓度为2.0g/L的酵母粉溶液、浓度为
2.5g/L的KH2PO4溶液、浓度为3.0g/L的Na2HPO4溶液、浓度为1.0g/L的NH4Cl溶液、浓度为0.4g/L的MgSO4溶液 、浓度为0.5g/L的半胱氨酸溶液、维生素储液lmL/L、微量金属元素储液lmL/L以及浓度为0.05g/L的刃天青溶液；所述维生素贮液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B12和100.0mg的盐酸吡卩多醇组成；所述微量金属元素储液每IL由1.5g的FeCl2、70mg的ZnCl2、6mg的硼酸0.1g的MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、0.19g 的 CoCl2.6H20、24mg 的 NiCl2.6H20、36mg 的 Na2MO4.H20,15mg 的Na2WO4.2H20 和 15mg 的 Na2SeO4.5H20 组成；
[0047]步骤三中所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824购买于中国普通微生物菌种保藏中心，其种子液接种量是2%的生长至对数期、600nm条件下OD值为1.0的液体悬浊液。
[0048]实验结果:
[0049]步骤一中，经过碱预处理的木质纤维素中，木质素含量显著下降，半纤维素含量有所减少，进而纤维素相对含量有所上升。说明碱预处理能够有效的打破木质素、半纤维素对纤维素的包裹和缠绕作用，有利于纤维素酶与纤维素分子的接触，以达到提高纤维素酶水解效率的目的；
[0050]步骤二中，分别对绿色木霉粗酶液、黑曲霉粗酶液、混合纤维素酶粗酶液进行酶活力测定和比较，绿色木霉具有较高的内切葡聚糖酶活性(6.74U)及外切葡聚糖酶活性(5.47U)，但是其β_1，4-葡萄糖苷酶活性较低(0.25U)，造成纤维素水解过程中纤维二糖的大量积累，滤纸酶活较低(3.16U);相对应的黑曲霉纤维素酶系中内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性较绿色木霉低，滤纸酶活也仅为3.09U,但是其β -1, 4-葡萄糖苷酶活性相对于绿色木霉显著提高(2.76U);两者混合粗酶液其滤纸酶活能够达到6.17U，相较于各自原始菌株均有很大程度的提升。对预处理的纤维素进行水解反应，得到糖含量超过17g/L的水解液，纤维素失重率超过85%，糖化效率达到75% ；
[0051]步骤三中厌氧发酵体系每6h取样，经过离心和滤膜过滤，对上清中的发酵液产物应用安捷伦6890N型高效液相色谱进行分析，发现步骤三从12h开始有丁醇产生，发酵持续60~96h结束， 最终的丁醇产量1.05g/L，产率为0.141g/g substrate。
【权利要求】
1.一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于，它是按以下步骤实现: 一、对木质纤维素采用碱预处理:木质纤维素与质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液按质量比为1:9的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100°C条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至PH为中性并在105°C条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素； 二、混合粗酶液的获得:将绿色木霉和黑曲霉分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为(2~4):1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液； 其中，液体发酵的具体操作如下:分别绿色木霉孢子和黑曲霉孢子接种到绿色木霉的液体产酶培养基和黑曲霉的液体产酶培养基中，然后在好氧发酵温度为28~32°C、转速为80~120r/min的条件下振荡培养4~6d,发酵过程结束后发酵液分别以5000g离心15min,分别收集上清液，所得上清液分别为绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液； 三、将步骤一得到的预处理的木质纤维素按质量体积比为0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步骤二得到的混合纤维素酶粗酶液中，在水解体系pH值4.0~5.5、温度为50~60°C的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48~60h，然后经5000g离心15min，取上清液后浓缩，再加入厌氧培养基中并通入氮气除氧，再接入丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵96h，即完成利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇； 其中，步骤二中所述的所述绿色木霉的孢子接种量为IO8~IO9个/L，所述的绿色木霉的液体产酶培养基含有浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4.7Η 20溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的尿素溶液、浓度为20g/L的麸皮溶液、浓度为8g/L的玉米秸杆溶液、浓度为5g/L的豆饼粉溶液以及微量金属元素贮液lmL/L ;所述的微量金属元素贮液母液含有浓度为5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.6g/L的MgSO4溶液、浓度为1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及浓度为2.0g/L的CoCl2溶液； 步骤二中所述的黑曲霉的孢子接种量为IO12~IO16个/L ;所述的黑曲霉的液体产酶培养基含有浓度为1.0g/L的麸皮溶液、浓度为1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、浓度为2.0g/L的KH2PO4溶液、浓度为0.3g/L的CaCl2溶液、浓度为0.3g/L的MgSO4溶液、浓度为1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、浓度为1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和浓度为2.0mg/L的CoCl2溶液； 步骤三中所述的厌氧培养基中含有浓度为2.0g/L的酵母粉溶液、浓度为2.5g/L的KH2PO4溶液、浓度为3.0g/L的Na2HPO4溶液、浓度为1.0g/L的NH4Cl溶液、浓度为0.4g/L的MgSO4溶液、浓度为0.5g/L的半胱氨酸溶液、维生素储液lmL/L、微量金属元素储液lmL/L以及浓度为0.05g/L的刃天青溶液；所述维生素贮液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B12和100.0mg的盐酸吡哆醇组成；所述微量金属元素储液每IL由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2H20、0.19g的 CoCl2.6H20、24mg 的 NiCl2.6H20、36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2H20 和 15mg 的Na2SeO4.5H20 组成； 步骤三中所述的丙酮丁醇梭菌，其种子液接种量是按体积百分含量为2%的生长至对数期、600nm条件下OD值为1.0的液体悬浊液。
2.根据权利要求1所述的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于步骤二中所述的将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为3:1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于步骤三中所述的取上清液后浓缩是指采用减压蒸馏的方法浓缩至上清液2~4倍浓度。
4.根据权利要求1所述的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于步骤二中所述的在好氧发酵温度为28~32°C、转速为100~120r/min的条件下振荡培养4d。
5.根据权利要求1所述的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于步骤三中所述的在水解体系pH值4.0~5.5、温度为55~60°C的条件下对预处理的 木质纤维素进行酶水解48h。
【文档编号】C12R1/145GK104004794SQ201410289117
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】杨谦, 王震宇, 曹广丽, 宋金柱, 赵磊, 冯丽平 申请人:哈尔滨工业大学