一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种沙门氏菌血清型鉴定方法，包括：1)提取待测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测，其中，PCR检测靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；5)比对结果的判断，可同时鉴定23种沙门氏菌常见血清型。本发明还提供了一种沙门氏菌血清型的鉴定试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物，并提供23种沙门氏菌常见血清型的标准间隔序列表。
【专利说明】一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本发明涉及沙门氏菌血清型的 鉴定方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌（Salmonella)为杆状的革兰氏阴性肠道菌，兼性耗氧，大多数菌株可在 没有特殊生长因子的合成培养基上生长。沙门氏菌是极其重要的食源性致病菌，对人类和 动物都具有极大危害，而且能够在人体与动物体间进行传播。近几十年来，由沙门氏菌引起 的食物中毒占世界食物中毒病例的第一或第二位。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占 食物中毒事件总数的30%-90%，中毒人数占食物中毒总人数的60% -90%，而在细菌性食 物中毒的病原中，沙门氏菌约为40%。沙门氏菌血清型的种类繁多，目前已达两千多种，有 些沙门氏菌血清型与其致病性息息相关，而有些血清型并不致病。常见的食物中毒主要由 一些特定的血清型感染引起，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔比 沙门氏菌等，因此对于研究沙门氏菌的致病机理及流行病学监测，血清型的鉴定是十分必 要的。
[0003] 当前，我国对于沙门氏菌的检测主要是依靠国标（GBT4789. 4-2010)的方法，根据 沙门氏菌的生化反应，以及抗原抗体反应进行分型鉴定。但是此方法存在一些缺陷，抗原和 分型血清的制备比较复杂，另外，沙门氏菌的抗原与血清的凝集反应有时较为迟缓，反应较 弱，易造成错误的分型结果。有些分子分型方法如脉冲场凝胶电泳（PFGE)、多位点序列分型 (MLST)等，其分型结果也可以与不同血清型对应起来，但是PFGE法操作较为繁琐，对于操 作者的技术水平要求很高，而MLST法需要同时扩增七个看家基因并进行测序和序列分析， 耗时较长，成本较
[0004] 建立一种行之有效的食源性沙门氏菌血清型的鉴定方法，以提高其血清型鉴定的 速度和准确度，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品安全和口岸检疫中都有重 要意义。
[0005] 最近发现，在细菌和古菌中广泛存在着成簇规律间隔短回文重复序列，即CRISPR。 沙门氏菌通常含有两个CRISPR系统，S卩CRISPR1和CRISPR2,它可以使细菌对噬菌体或质粒 等外源DNA实现免疫，而CRISPR系统中的间隔序列在免疫过程中发挥着重要作用，是用来 识别外源DNA的标签，不同的间隔序列与不同噬菌体或质粒上的序列存在高度同源性。同 时，在细菌进化过程中间隔序列存在插入和选择性剔除的现象，使其具备多态性，进而在不 同菌株间存在特征性的差异。
[0006] 为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种基于沙门氏菌CRISPR1 和CRISPR2前三个间隔序列保守性的沙门氏菌血清型快速鉴定方法。
[0007] 这种沙门氏菌血清型快速鉴定方法针对沙门氏菌血清型CRISPR位点中间隔序列 特异性强，可有效区分沙门氏菌不同血清型，快速、灵敏，并可以应用于食源性沙门氏菌不 同血清型的鉴定。
【发明内容】
[0008] 有鉴于现有技术存在上述的问题，本发明的目的是提供一种快速、灵敏的沙门氏 菌血清型鉴定方法。为此，本发明的技术方案为：一种沙门氏菌血清型的鉴定方法，包括以 下步骤：
[0009] 1)提取待检测样品中的DNA ;
[0010] 2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏 菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ;
[0011] 3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；
[0012] 4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并 与各血清型标准间隔序列进行同源比对；
[0013] 5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清 型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型。
[0014] 其中蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌由于CRISPR2基因的扩增产物拷贝数过 低或扩增产物片段太小，在测序时不能得出正确的序列信息，而通过多次分离株的验证，发 现其CRISPR1基因的前三个间隔序列已经具有较强的血清型特异性，能够作为血清型鉴别 的依据，故只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。
[0015] 本发明之所以选CRISPR1和CRISPR2的前三个间隔序列作为检测靶标是通过如下 方法筛选得到的：
[0016] 选取23种不同血清型，每种血清型各有几种不同的标准菌株，利用CRISPR1和 CRISPR2 的对应的引物 CRISPR1-F，CRISPR1-R 和 CRISPR2-F，CRISPR2-R，进行 PCR 扩增， 可以得到不同大小的CRISPR1和CRISPR2片段，其中同一血清型的片段大小相近，不同血 清型的片段大小差异明显，将PCR产物送商业测序公司测序，测得序列利用在线免费软件 CRISPRfinder(http://crispr. u-psud. fr/Server/)分析，找出 CRISPR1 和 CRISPR2 各自的 重复序列和间隔序列，重复序列一般为5' -CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3'，然而间隔 序列的差异较大，其中差异主要分为两个方面：第一个方面，在相同沙门氏菌血清型的菌株 中，间隔序列的数目有差别，如肠炎沙门氏菌的CRISPR2中普遍含有十个间隔序列，但是有 部分的菌株在菌株进化过程中缺失了或者增加了间隔序列，因此造成同一血清型沙门氏菌 菌株之间的差异，但是最为重要的一点是，相同沙门氏菌血清型的菌株之间开头的间隔序 列的碱基序列是相同的，也是特异的。第二个方面，在不同沙门氏菌血清型的菌株之间，不 论在间隔序列的数目上以及在间隔序列的碱基序列上均有很大差异，尤其是间隔序列的碱 基序列，在不同血清型的菌株间没有共有的。综上，根据相同沙门氏菌血清型菌株间隔序 列的碱基序列的共性，不同沙门氏菌血清型菌株之间间隔序列的碱基序列的差异性，选取 CRISPR的前三个间隔序列作为鉴别沙门氏菌不同血清型的靶标序列。
[0017] 建立不同血清型沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列的序列库。待检测 的菌株CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列与序列库中前三个间隔序列比对，与某一标准 血清型的前三个间隔序列中至少两个一致即判定为对应的血清型。
[0018] 这种新的沙门氏菌血清型鉴定方法的CRISPR1和CRISPR2的引物是通过公用 CRISPR数据库检索下载并海量搜集CRISPR1和CRISPR2的上下游侧翼序列，BLAST比对 CRISPR1和CRISPR2的侧翼序列，分别得到保守的上下游的碱基序列，利用primer5. 0设计 出引物 CRISPR1-F 和 CRISPR1-R，CRISPR2-F 和 CRISPR2-R。
[0019] 在本发明中，样品是潜在含有沙门氏菌菌株的离体样品，包括食品、血液、血液制 品、唾液、医疗用品或药品等。由于沙门氏菌是食源性致病菌，检测来自于食品的样品，属食 品安全检测领域。提取DNA以及PCR检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌 握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本发明的【具体实施方式】中，可 以使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取菌体基因组DNA，可以使用普通的PCR仪完成PCR 检测。
[0020] 优选在本发明中，CRISPR1和CRISPR2PCR检测引物为CRISPR1-F (序列为 5' -ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'）和 CRISPR1-R(序列为 5' -TTGATGAGTATGGTGGTTGTGGT-3'）， CRISPR2-F(序列为 5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3'）和 CRISPR2-R(序列为 5' -GTTGGTAGAATGTG GTGC-3'）。
[0021] PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，一般为五步法，预变性、变性、退 火、延伸、再延伸。根据本发明人研究，最优选的CRISPR1和CRISPR2的PCR扩增条件如下：
[0022] CRISPR1 :95°C预变性 10min，95°C变性 lmin，60. 5°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，进 行35个循环，最后72°C延伸lOmin ;
[0023] CRISPR2 :95°C预变性 10min，95°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，进行 35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0024] 本发明还提供了一种沙门氏菌血清型的检测试剂盒，包括：
[0025] 1)用于扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。优选地，所述引物为引 物 CRISPR1-F(序列为 5' -ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'）和 CRISPR1-R(序列为 5' -TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3，），CRISPR2-F(序列为 5，-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3，）和 CRISPR2-R(序列为 5' -GTTGGTAGAATGTG GTGC-3'）。
[0026] 2)沙门氏菌常见血清型的CRISPR1和CRISPR2前三个标准间隔序列表。
[0027] 3)检测试剂盒还可以包括提取DNA和/或PCR检测中所用的试剂。这些试剂都是 常用试剂，也可以通过市场渠道购买。
[0028] 优选地，本发明可鉴定沙门氏菌的血清型为23种，分别为鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis)、婴儿沙门氏菌 (Salmonella Infantis)、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙门氏 菌（Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙门氏菌（Salmonella Senftenberg)、蒙得维亚沙 门氏菌（Salmonella Montevideo)、布伦登卢沙门氏菌（Salmonella Braenderup)、斯坦利 沙门氏菌（Salmonella Stanly)、汤卜逊沙门氏菌（Salmonella Thompson)、阿贡那沙门氏 菌（Salmonella Agona)、鸭沙门氏菌（Salmonella Anatum)、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pollorum)、德尔比沙门氏菌（Salmonella Derby)、圣保罗沙门氏菌（Salmonella Saintpaul)、印第安纳沙门氏菌（Salmonella Indiana)、甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella Paratyphi A)、田纳西沙门氏菌（Salmonella Tennessee)、火鸡沙门氏菌（Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙门氏菌（Salmonella Kottbus)、爪睡那沙门氏菌（Salmonella Javiana)、伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhi)和塞罗沙门氏菌（Salmonella Cerro)。
[0029] 本发明取得的有益效果在于：沙门氏菌血清型鉴定的CRISPR间隔序列的特异性 强，可有效区分不同沙门氏菌血清型，使得检测结果更能满足实际食品安全检测的需求；检 测方法快速、灵敏度高。
[0030] 为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特 别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书 的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1是采用本发明实施例中PCR体系获得的不同血清型沙门氏菌CRISPR1的扩增 电泳图。
[0032] 图2是采用本发明实施例中PCR体系获得的不同血清型沙门氏菌CRISPR2的扩增 电泳图。
【具体实施方式】
[0033] 以下将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术 人员所熟悉的《分子克隆实验指南》（第三版）（科学出版社，北京，中国，2005年）等实验 手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。
[0034] 一.主要试剂和仪器
[0035] 以下描述中提到的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，购自美国Qiagen公司（Cat. No. 51304) ;ABI9700 普通 PCR 仪，购自 ABI 公司。
[0036] 二.菌株以及DNA的抽提
[0037] 菌株均可以购自于中国医学细菌保藏管理中心（CMCC)、美国典型微生物保藏中心 (ATCC)、新西兰环境科学研究所医学部微生物保藏中心（NZRM)，菌株编号如表1所示。培养 方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒来提取细菌基因组DNA。
[0038] 表1沙门氏菌不同血清型标准菌株以及用本发明的PCR方法检测CRISPR的结果
[0039]
【权利要求】
1. 一种沙门氏菌血清型鉴定方法，其特征在于，包括步骤： 1) 提取待检测样品中的DNA ; 2) 将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ; 3) 将步骤2)中的PCR产物进行序列测定； 4) 借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并与各 血清型标准间隔序列进行同源比对； 5) 比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的 CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型； 其中，蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即 可。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所 GAGTATGGTGGTTGTGGT-3' 。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用的引物为： CRISPR2-F :5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3' 和 CRISPR2-R :5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所用PCR的扩 增条件为：95°C预变性10min，95°C变性lmin，60. 5°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行35个 循环，最后72°C延伸lOmin。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用PCR的扩 增条件为：95°C预变性10min，95°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行35个循 环，最后72°C延伸lOmin。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙门氏菌为以下23种中的一种：鼠伤 寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis)、婴儿沙 门氏菌（Salmonella Infantis)、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙 门氏菌（Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙门氏菌（Salmonella Senftenberg)、蒙得维亚 沙门氏菌（Salmonella Montevideo)、布伦登卢沙门氏菌（SalmonellaBraenderup)、斯坦利 沙门氏菌（Salmonella Stanly)、汤卜逊沙门氏菌（Salmonella Thompson)、阿贡那沙门氏 菌（Salmonella Agona)、鸭沙门氏菌（Salmonella Anatum)、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pollorum)、德尔比沙门氏菌（Salmonella Derby)、圣保罗沙门氏菌（Salmonella Saintpaul)、印第安纳沙门氏菌（Salmonella Indiana)、甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella Paratyphi A)、田纳西沙门氏菌（Salmonella Tennessee)、火鸡沙门氏菌（Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙门氏菌（Salmonella Kottbus)、爪睡那沙门氏菌（Salmonella Javiana)、伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhi)和塞罗沙门氏菌（Salmonella Cerro)。
7. -种沙门氏菌血清型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于PCR扩增沙门 氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为检测CRISPR1 5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3'，检测 CRISPR2 所用的 PCR 引物 CRISPR2-F : 5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3' 和 CRISPR2-R :5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。
9. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括常见不同血清型沙门氏菌的 CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列的序列表。
10. 如权利要求7-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括提取DNA和/或PCR检 测中所用的试剂。
【文档编号】C12R1/42GK104059977SQ201410293102
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】施春雷, 庄孝飞, 周秀娟, 史贤明, 崔妍 申请人:上海交通大学