一种培养鸡hd11巨噬细胞的新方法
【专利摘要】一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，检测最佳培养体系，得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案，发现培养基RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养和当培养基含2.5％的鸡血清时，培养效果最优。
【专利说明】-种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物细胞培养领域具体涉及细胞培养技术。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重 要对象。鸡HD11巨噬细胞属于悬浮细胞，该细胞的现有的培养体系：RPMI1640(Sigma公 司），10%新生牛血清补充（热灭活），10.0mMHEPES，1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸， 2. OmM谷氨酰胺，100U .mL-l的青霉素100 μ g/ml链霉素，5 X 10-5M2-巯基乙醇（pH值7. 3) 和5%的二氧化碳。培养瓶横放如培养箱时培养基的深度超过5_，当培养瓶直立放置时， 培养基高度超过l〇cm，还需要深层通入C02和空气，以保证足够的气体交换。
[0003] 鸡HD11巨噬细胞目前的培养体系存在细胞生长缓慢，增殖效率低以及转染效率 低等问题，影响了巨噬细胞在相关科学研究中的应用，阻碍了家禽免疫研究进展。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术的问题，本发明以鸡巨噬细胞（HD11细胞）为研究对象，改进培 养体系，用RPMI1640和DMEM两种不同培养基培养，并分别添加不同比例胎牛血清和鸡血 清，在不同培养期间比较HD11细胞培养效果，旨在建立一种新的培养方法。本发明采用的 技术方案如下：
[0005] -种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养 基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过 MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞生长曲 线，检测最佳培养体系，具体步骤为：
[0006] (1)HD11细胞的准备：取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶；
[0007] (2)MTT溶液的制备：称取125mg MTT，放入小烧杯中，加25mL PBS(0. Olmol/L， pH7. 4)，在磁力搅拌机上搅拌30min，用0. 22 μ m的过滤器过滤除菌，分装，4°C保存，两周内 有效，二甲基亚砜（DMS0,使用分析纯产品）；
[0008] (3)培养基，胎牛血清及鸡血清的准备：分别准备两种未添加任何血清的培养 基--RPMI1640和DMEM，各50mL，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25mL ;
[0009] 所述步骤（3)的具体步骤为：
[0010] 1)取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；
[0011] 2)收集细胞，用PBS清洗2-3次，离心（1000rpm，5min)弃上清，分别用未加任何血 清的RPMI1640和DMEM重悬备用；
[0012] 3)分别制备含不同鸡血清的两种培养基：
[0013] A. RPMI1640
[0014] [1^]\〇1640+10%?85+2.5%鸡血清 + 重悬细胞；
[0015] j. RPMI1640+10% FBS+5%鸡血清 + 重悬细胞；
[0016] k. RPMI1640+10% FBS+10%鸡血清 + 重悬细胞；
[0017] 1.RPMI1640+15% 鸡血清 + 重悬细胞；
[0018] B.DMEM;
[0019] 111.01^]\1+10%卩85+2.5%鸡血清 + 重悬细胞；
[0020] n. DMEM+10% FBS+5% 鸡血清 + 重悬细胞；
[0021] 〇· DMEM+10% FBS+10%鸡血清 + 重悬细胞；
[0022] ρ· DMEM+15%鸡血清+重悬细胞；
[0023] 4)接种细胞：按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复；
[0024] 5)细胞培养：放入C02培养箱，在5% C02、37°C条件下，按设计的时间分别培养5 小时、10小时、24小时、48小时；
[0025] 6)呈色：按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL)20uL，37°C继续孵育4小 时，终止培养，离心（l〇〇〇r/min，15min)小心弃去孔内培养液，每孔加入150uL DMS0,振荡 lOmin，使甲臜充分溶解；
[0026] 7)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以 时间为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞生长曲线；
[0027] 8)结果：RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间 比较差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著，两种培养基与不同培养时 间之间互作比较，差异不显著；不同培养基与不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著； 不同培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著；通过 两种多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为2. 5%与其他三种鸡血清浓 度有极显著的差异；并得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为：RPMI1640(Sigma公 司），10%新生牛血清补充（热灭活），10.0禮服^，1.011^丙酮酸钠，0.11111非必需氨基酸， 2. OmM谷氨酰胺，100U .πιΓ1的青霉素100 μ g/ml链霉素，5 X 10_5M2-巯基乙醇（pH值7. 3)， 2. 5 %鸡血清。
[0028] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
[0029] 鸡巨噬细胞HD11能够更快、更好的生长，提高增殖效率，新的培养体系，使细胞迅 速增长，且细胞活力增加，缩短试验时间，使后续试验更好的进行。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图 1 :5h，DMEM+10%胎牛血清 +2. 5%鸡血清；
[0031] 图2:1011，01^]\1+10%胎牛血清+2.5%鸡血清；
[0032] 图 3 :24h, DMEM+10%胎牛血清 +2. 5%鸡血清；
[0033] 图4:4811,01^1+10%胎牛血清+2.5%鸡血清；
[0034] 图 5 :5h，RPMI1640+10%胎牛血清 +2. 5%鸡血清；
[0035] 图6:1011，1^]\01640+10%胎牛血清+2.5%鸡血清；
[0036] 图 7 :24h，RPMI1640+10%胎牛血清 +2. 5%鸡血清；
[0037] 图8:4811，1^]\〇1640+10%胎牛血清+2.5%鸡血清；
[0038] 图9不同培养基之间的细胞生长图 图10不同鸡血清浓度之间的细胞生长图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
[0040] 实施例
[0041] 本发明的技术方案是：分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例 的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，检 测最佳培养体系。
[0042] 具体步骤为：首先用两种不同培养基按设置的时间培养细胞；其次用MTT比色试 验检测，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞生长曲线。
[0043] 1材料与方法
[0044] 1. 1 材料
[0045] 1. 1. 1HD11细胞的准备
[0046] 取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶。
[0047] 1. 1. 2MTT溶液的制备
[0048] 称取125mg MTT，放入小烧杯中，加25mL PBS(0. 01mol/L，ρΗ7· 4)，在磁力搅拌机上 搅拌30min，用0. 22 μ m的过滤器过滤除菌，分装，4°C保存。两周内有效。二甲基亚砜（DMS0， 使用分析纯产品）
[0049] 1. 1. 3培养基，胎牛血清及鸡血清的准备
[0050] 分别准备两种未添加任何血清的培养基--RPMI1640和DMEM，各50mL，预热；预 热好的胎牛血清和鸡血清各25mL。
[0051] 具体步骤：
[0052] (1)取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；
[0053] (2)收集细胞，用PBS清洗2-3次，离心（1000rpm，5min)弃上清，分别用未加任何 血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；
[0054] (3)分别制备含不同鸡血清的两种培养基：
[0055] A. RPMI1640
[0056] q. RPMI1640+10 % FBS+2. 5 %鸡血清 + 重悬细胞
[0057] r. RPMI1640+10 % FBS+5 %鸡血清 + 重悬细胞
[0058] s. RPMI1640+10% FBS+10%鸡血清 + 重悬细胞
[0059] t. RPMI1640+15%鸡血清+重悬细胞
[0060] B. DMEM
[0061] 11.01^]?+10%?85+2.5%鸡血清 + 重悬细胞
[0062] V. DMEM+10% FBS+5% 鸡血清 + 重悬细胞
[0063] w. DMEM+10% FBS+10% 鸡血清 + 重悬细胞
[0064] x.DMEM+15%鸡血清+重悬细胞
[0065] (4)接种细胞：按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复。
[0066] (5)细胞培养：放入C02培养箱，在5% C02、37°C条件下，按设计的时间分别培养5 小时、10小时、24小时、48小时。
[0067] (6)呈色：按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL) 20uL，37°C继续孵育4 小时，终止培养，离心（l〇〇〇r/min，15min)小心弃去孔内培养液，每孔加入150uLDMS0,振荡 lOmin，使甲臜充分溶解。
[0068] (7)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以 时间为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞生长曲线。
[0069] 2 结果
[0070] 2. 1不同培养体系之间培养效果比较：见表1
[0071] 表1 :不同培养体系之间培养效果比较
[0072]
【权利要求】
1. 一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于：分别用RPMI1640和DMEM两种不 同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时 后，通过MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞 生长曲线，检测最佳培养体系，具体步骤为： (1) HD11细胞的准备：取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶； (2) MTT溶液的制备：称取125mg MTT，放入小烧杯中，加25mL PBS(0. 01mol/L，ρΗ7· 4)， 在磁力搅拌机上搅拌30min，用0. 22 μ m的过滤器过滤除菌，分装，4°C保存，两周内有效，二 甲基亚砜（DMS0,使用分析纯产品）； (3) 培养基，胎牛血清及鸡血清的准备：分别准备两种未添加任何血清的培养基-- RPMI1640和DMEM，各50mL，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25mL ; 所述步骤（3)的具体步骤为： 1) 取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数； 2) 收集细胞，用PBS清洗2-3次，离心（1000rpm，5min)弃上清，分别用未加任何血清的 RPMI1640和DMEM重悬备用； 3) 分别制备含不同鸡血清的两种培养基： A. RPMI1640 &.1^]\〇1640+10%?85+2.5%鸡血清 + 重悬细胞； b. RPMI1640+10% FBS+5%鸡血清 + 重悬细胞； c. RPMI1640+10% FBS+10%鸡血清 + 重悬细胞； d. RPMI1640+15 %鸡血清+重悬细胞； B. DMEM ； 6.01^]?+10%卩85+2.5%鸡血清+重悬细胞； f. DMEM+10% FBS+5%鸡血清+重悬细胞； g. DMEM+10% FBS+10%鸡血清+重悬细胞； h. DMEM+15%鸡血清+重悬细胞； 4) 接种细胞：按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复； 5) 细胞培养：放入C02培养箱，在5% C02、37°C条件下，按设计的时间分别培养5小时、 10小时、24小时、48小时； 6) 呈色：按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL)20uL，37°C继续孵育4小 时，终止培养，离心（l〇〇〇r/min，15min)小心弃去孔内培养液，每孔加入150uL DMS0,振荡 lOmin，使甲臜充分溶解； 7) 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间 为横轴，光吸收值（A)为纵轴绘制细胞生长曲线； 8) 结果：RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间比较 差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著，两种培养基与不同培养时间之 间互作比较，差异不显著；不同培养基与不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著；不同 培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著；通过两种 多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为2. 5%与其他三种鸡血清浓度有极 显著的差异；并得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为：RPMI1640(Sigma公司）， 10 %新生牛血清补充（热灭活），10. OmM HEPES，1. OmM丙酮酸钠，0. ImM非必需氨基酸， 2. OmM谷氨酰胺，100U .mL-1的青霉素100 μ g/ml链霉素，5 X 10_5M2-巯基乙醇（pH值7. 3)， 2. 5 %鸡血清。
2. -种根据权利要求1所述的培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于：培养基 RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养。
3. -种根据权利要求1所述的培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于：当培养基 含2. 5%的鸡血清时，培养效果最优。
【文档编号】C12N5/0786GK104059879SQ201410317770
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】刘向萍, 窦新红, 常国斌, 王克华, 朱静, 陈国宏 申请人:江苏省家禽科学研究所