同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法
【专利摘要】本发明提供了一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，所述特异性引物序列为：上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。本发明还提供了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括：(1)提取柑桔待测样品总RNA；(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA；(3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测。该方法检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。
【专利说明】同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学的病毒检测领域，具体的说，涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加大。
[0003]温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus, SDV)弓丨起的温州蜜柑萎缩病主要危害温州蜜柑，造成温州蜜柑果实的畸形，影响果实品质，使其失去经济价值。一般发病10年以上的植株明显矮化，产量锐减(只有健康树的40-50%)，严重时全无收成。病树主干直径比健康树小20-30%，树冠小50-60%。上世纪80年代我国从日本引进温州蜜柑品种，SDV随带毒的接穗和苗木传入我国，该病相继在浙江、四川、湖北、湖南、广西等地发生。
[0004]柑桔花叶病毒(Citrus mosaic virus,CiMV)引起的柑桔花叶病最早发现于日本，病果的果皮部分或整个不着色，同时出现云纹状或轮纹状的斑驳；糖、酸含量低，没有经济价值。高接在温州蜜柑上的柠檬、金柑的果实也产生斑驳，且与感病温州蜜柑混栽的日本夏橙、伏令夏橙、鸣门柑、代代酸橙、八朔柑等春梢的嫩叶上会产生斑驳、杂色花叶、黄脉以及镶边脉等症状。
[0005]CiMV是SDV的分离株，两者具有亲缘关系。传统的柑桔病毒病检测方法主要是指示植物鉴定，夏代代、香橼、柠檬等鉴定SDV，枸头橙、马叙葡萄柚、白芝麻等鉴定CiMV，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。目前也有检测SDV和CiMV的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。
[0006]实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与目前使用的生物学鉴定，血清学检测和PCR等检测技术相比，实时荧光RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，较普通RT-PCR的灵敏度高出10-100倍，而且能对病原体的数量进行精确定量。SYBR Green I染料法具有灵敏度高、信噪比高、适用范围广和低价等特点。在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。并且普通RT-PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。目前已建立了 SDV和CiMV的单一 RT-PCR分子检测技术，但尚未见2种病害同时检测的实时荧光RT-PCR体系的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的能同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
[0008]本发明解决其技术问题采用的技术方案:一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下:
[0009]上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3，；
[0010]下游引物:5’ -TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3，。
[0011]本发明还涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括:
[0012](I)提取柑桔待测样品总RNA ；
[0013](2)样品总RNA经反转录获得其cDNA ；
[0014](3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测，根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；所述特异性引物核苷酸序列如下:
[0015]上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3，；
[0016]下游引物:5’ -TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3，。
[0017]根据Ct值进行判断，当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。
[0018]所述CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
[0019]步骤(3)所述PCR 反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μ L ;10 μ M 的上、下游引物各0.2 μ L, cDNA模板I μ L,超纯水11.1 μ L。
[0020]步骤(3)所述PCR反应程序为:95°C 5s，60°C 30s，采集荧光信号，共40个循环。
[0021]本发明的有益效果是:本发明通过设计能针对两种病毒的实时荧光定量RT-PCR特异性引物，建立了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，能同时检测柑桔2种重要嫁接传播病原，快速准确，避免了常规PCR的重复检测。且检测特异性强，灵敏度高，稳定性好，工序简单，节约成本，适用于大规模推广，有利于摸清田间CiMV和SDV病害发生状况，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，加速引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR检测结果分析。
[0023]图2为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品RT-PCR扩增产物电泳图。M:100bp DNA分子量标准；1:SDV ；2 =CiMV0
[0024]图3为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品实时荧光RT-PCR扩增阳性样品的融解曲线图。
[0025]图4为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR特异性检测图。
[0026]图5为SDV实时荧光RT-PCR灵敏性检测图。1:SDV抽提样品；2_7 =SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释，2-7稀释倍数依次为10—1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6。
[0027]图6为SDV普通RT-PCR灵敏性检测图。1:SDV抽提样品；2_7 =SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释，2-7稀释倍数依次为10' 10_2，10_3，10_4，10_5，10-6.
【具体实施方式】
[0028]实施例1提取样品总RNA
[0029]以7份西南大学柑桔实验基地田间采集的柑桔叶片作为待测样品，以分别感染有CiMV和SDV的柑桔叶片(西南大学柑桔研究所的毒源库保存的毒源)作为阳性样品，提取该9份待测样品总RNA，按照如下步骤操作:
[0030](1)取样、研磨:取嫩叶的中脉或嫩皮，从同一植株的不同方位取样，每个样品重复抽提3次，以降低这2种病原的漏检率提高检测的可靠性。取10-15mg皮或叶脉于无菌eppendorf管，液氮研磨；
[0031](2)依次加入60 μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀；
[0032](3) 7CTC水浴 5-10min, 12000rpm 离心 5min ；
[0033](4)吸取 40 μ L 上清液于 Sephadex G-50-80 层析柱中，5000rpm 离心 4min,收集洗脱液，_20°C保存。所述层析柱制备方法为:加少量TNE平衡的玻璃珠到0.5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中，并向
0.5mL 的 Eppendorf 管内加满用 TNE 饱和的 Sephdex G-50, 5000rpm,离心 3min,取出 0.5mL的Eppendorf管置入1.5mL的Eppendorf管中即可制成。
[0034]实施例2cDNA合成:
[0035]将实施例1提取得到的9份总RNA反转录为cDNA，方法如下:将I μ L总RNA在94°C变性，冰水浴2min后，按照反转录试剂盒使用说明，加入cDNA合成所需试剂，利用PCR仪进行扩增。
[0036]cDNA合成所需体系如下:模板总RNA I μ L，10 μ M下游引物0.25 μ L，5 XPCRbuffer2 μ L, 1mM dNTPs0.5 μ L, RNAsin0.25 μ L, RTase0.25 μ L,超纯水 5.75 μ L。
[0037]cDNA 合成条件为:42°C，30min。
[0038]实施例3实时荧光RT-PCR检测:
[0039]一、利用实施例2得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测:
[0040]实时荧光RT-PCR 检测反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq II 12.5μ L ；10μΜ上、下游引物各0.2 μ L，cDNA模板I μ L，超纯水11.lyL。所述引物序列为:上游引物:5’ -CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’，下游引物:5’ -TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
[0041]反应条件为:95°C 5s,60°C 30s，采集荧光信号，共40个循环。
[0042]二、检测结果分析:
[0043]检测结果用B1-Rad iQ5软件进行分析，得到如图1所示结果值，F05为阴性对照，FOl是SDV阳性样品，F02是CiMV阳性样品，其余7个为田间采集的未知待测样品。当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。由图1可见，田间采集的7个待测样品均带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种。
[0044]将阳性样品一已知感染CiMV和SDV的叶片的扩增产物进行凝胶电泳，电泳图如图2所示，该特异引物扩增的片段长度为160bp。对扩增产物用PCR产物纯化试剂盒切胶回收，纯化产物经过测序预处理后，送基因公司测序，使用NCBI的BLAST登录序列进行同源性比对分析，验证分别为CiMV和SDV的特异基因片段。
[0045]利用该特异引物进行实时荧光RT-PCR检测，其融解曲线只有单一峰，如附图3所示，表明无非特异性条带的扩增。
[0046]三、特异性测试:
[0047]用感染柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)、柑桔碎叶病毒(Citrustatter leaf virus, CTLV)、鱗皮病毒(Citrus psorosis virus, CPV)、柑桔裂皮病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)、SDV以及CiMV的柑桔叶片的总RNA反转录得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测，如图4所示，由扩增的荧光曲线可以看出只有带SDV和CiMV的样品荧光信号才有增加，而其它样品荧光信号均无增加，表明只有SDV和CiMV的核酸得到了扩增，其它病毒核酸均无扩增，说明该体系检测SDV和CiMV的特异性强。
[0048]四、灵敏度测试:
[0049]用超纯水10倍梯度稀释带有SDV和CiMV的阳性样品的总核酸模板，检测普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR的灵敏度，结果均显示:普通RT-PCR能检测到10_5浓度梯度，而不能检测到10_6浓度梯度；实时荧光RT-PCR能检测出10_6浓度梯度，表明实时荧光RT-PCR灵敏度比普通RT-PCR高出10倍。SDV阳性样品10倍梯度稀释样品的实时荧光RT-PCR检测结果如图5所示，其普通RT-PCR的电泳检测结果如图6所示。
【权利要求】
1.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，其特征在于:所述特异性引物序列如下: 上游引物:5 ’ -CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3，； 下游引物:5’ -TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
2.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括: (1)提取柑桔待测样品总RNA； (2)样品总RNA经反转录获得其cDNA； (3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测， 根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；所述特异性引物核苷酸序列如下: 上游引物:5 ’ -CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3，； 下游引物:5’ -TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
3.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于:根据Ct值进行判断，当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。
4.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于:所述CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
5.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于:步骤(3)所述PCR反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq II 12.5μ L ；10μΜ的上、下游引物各0.2 μ L, cDNA模板I μ L,超纯水11.1 μ L。
6.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于:步骤(3)所述PCR反应程序为:95°C 5s, 60°C 30s，采集荧光信号，共40个循环。
【文档编号】C12Q1/70GK104073572SQ201410322816
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】刘科宏, 周常勇, 李中安, 周彦 申请人:西南大学柑桔研究所