原始卵泡激活剂及其应用的制作方法
【专利摘要】原始卵泡激活剂及其应用，包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸，mTOR信号通路激活剂II为20-50μM普萘洛尔；PI3K信号通路激活剂，包括PI3K信号通路激活剂III和IV，PI3K信号通路激活剂III为30-100μM的bpV，PI3K信号通路激活剂IV为250-500μg/mL的740Y-P。本发明涉及一种体外激活试剂盒，联合应用mTOR和PI3K信号通路激活剂能够激活小鼠和人卵巢组织中的原始卵泡并促进卵泡的发育。该试剂盒的开发可广泛用于辅助生殖领域治疗卵巢早衰等卵泡储备不足引起的疾病。
【专利说明】原始卵泡激活剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种原始卵泡激活剂及其应用，特别涉及一种mTOR和PI3K信号通路激活剂在原始卵泡体外激活试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]在哺乳动物中，生殖细胞的生长和成熟是一个受到激素精细调节的过程。这些激素包括来自下丘脑的促性腺激素和生殖器官自身产生的激素和生长因子等。在雌性哺乳动物体内，卵泡是一个卵巢的基本功能单位，由位于中央的卵子及外围一层或多层颗粒细胞构成。按照卵泡中卵母细胞的不同生长发育阶段，可以分为原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，腔卵泡，排卵前卵泡。原始卵泡是卵巢中处于静息状态的卵泡库，在哺乳动物出生前或出生后，其数量是固定的，人每个卵巢中的原始卵泡大约有400,000左右。在卵巢的生长发育过程中，卵巢中的原始卵泡不停的被激活，进入生长期经过初级卵泡和次级卵泡阶段。在次级卵泡阶段，在初情期前没有促性腺激素(FSH)分泌的情况下，这些卵泡就会死亡而发生卵泡闭锁，而初情期后，在下丘脑分泌的FSH的刺激下，就会有一个或数个次级卵泡周期性的进一步发育长大直至排卵前卵泡。在这个过程中卵母细胞的体积会增长几百倍，周围颗粒细胞数量也会迅速增加，由最初的单层6-9个细胞增加至数层上千个细胞。除了下丘脑分泌的促性腺激素外，卵泡的发育也受到卵巢内部产生的激素和生长因子的影响，比如在卵泡内卵母细胞和周围的颗粒细胞就可以通过旁分泌的形式互相影响对方的生长发育。最终在排卵前激素峰的总用下，排卵前卵泡中卵母细胞成熟而排卵，而残留的颗粒细胞和theca细胞则发生黄体化，分泌激素为受精卵的发育做准备。
[0003]在哺乳动物的卵巢中，原始卵泡库中不停有原始卵泡被激活而进入生长期，这个过程被称为初始招募(initial recruiment)。初始招募并不受FSH的调节,而是受卵巢产生的一些生长因子的影响。许多生长因子都被发现参与了这个过程如TOGF，SDF, EGF等。在人每个月大约有1000个左右的原始卵泡进入生长期，而当原始卵泡库中的原始卵泡不足于1000时，卵巢将不再排卵，而此时女性也将进入绝经期。正常女性进入绝经期的年龄都在50岁左右，而在一些病理条件下，由于卵巢中原始卵泡库中储备不足而令女性提前进入绝境期(40岁之前)而引起卵巢早衰。卵巢早衰是一种非常常见的不孕不育症,在育龄女性中的发病率大概在1%。目前，关于原始卵泡激活的机制研究还不是特别清楚，除了上述提到的一些生长因子，科学家们通过基因敲除小鼠的研究，发现信号通路PTEN-P13K-F0X03以及mT0R-p70S6K-rpS6在原始卵泡的激活中发挥重要的作用。因此如何找到一个有效的办法调节原始卵泡的激活将具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004]解决的技术问题:本发明提供一种原始卵泡激活剂及其应用，本发明的另一目的是提供一种原始卵泡体外激活试剂盒。
[0005]技术方案:原始卵泡激活剂，由mTOR信号通路激活剂和PI3K信号通路激活剂组成，所述mTOR信号通路激活剂包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200 μ M磷脂酸，mTOR信号通路激活剂II为20-50 μ M普萘洛尔；所述ΡΙ3Κ信号通路激活剂包括ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，PI3K信号通路激活剂III为30-100 μ M的bpV，PI3K信号通路激活剂IV为250-500 μ g/mL的740Y-P。
[0006]上述磷脂酸优选为200 μ Μ，普萘洛尔优选为50 μ Μ，所述bpV优选为30 μ Μ，740Υ-Ρ优选为250 μ g/mL。
[0007]上述原始卵泡激活剂在制备激活原始卵泡并促进卵泡发育药物中的应用。
[0008]原始卵泡体外激活试剂盒，包括以下组分:l)mT0R信号通路激活剂I和II ；2)PI3K信号通路激活剂III和IV ；3)基本激活细胞培养液；4)L-15培养液。
[0009]一种原始卵泡体外激活试剂盒，mTOR信号通路激活剂I为磷脂酸，其浓度为:50-200 yM^TOR信号通路激活剂II为普萘洛尔，其浓度为:20-50 μ M ;PI3K信号通路激活剂III为bpV，其浓度为30-100 μ M ;PI3K信号通路激活剂IV为740Υ-Ρ，其浓度为250-500 μ g/mL ;基本激活细胞培养液配方=MEMa为母液，内含丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗坏血酸50 μ g/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L。
[0010]一种原始卵泡体外激活试剂盒，试剂组成为:
[0011]溶液1:基本激活细胞培养液；
[0012]溶液II:L-15培养液为母液，内含人血清白蛋白1wt.% ；
[0013]试剂1:mT0R信号通路激活剂I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛尔，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量分别预先分装；
[0014]试剂I1:ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，含有30-100 μ M的的bpV和250-500 μ g/mL的的740Y-P，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量分别预先分装。
[0015]另一种原始卵泡体外激活试剂盒，试剂组成为:
[0016]溶液1:基本激活细胞培养液；
[0017]溶液II:L-15培养液为母液，内含人血清白蛋白1wt.% ；
[0018]试剂1:预混在一起的mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛尔，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
[0019]试剂I1:预混在一起的ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，含有30-100 μ M的PA和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装。
[0020]上述的原始卵泡体外激活试剂盒，将溶液1、试剂1、试剂I1、溶液II分别包装，再一同包装在同一包装盒内。
[0021]上述原始卵泡体外激活试剂盒的制备方法，溶液1:基本激活细胞培养液配制方法如下:MEMa为母液，含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗坏血酸50 μ g/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L ;所述试剂I含有mTOR信号通路激活剂包括:(I) mTOR信号通路激活剂I，50-200 μ M的磷脂酸，(2)mTOR信号通路激活剂II，20-50 μ M的普萘洛尔；所述试剂II含有ΡΙ3Κ信号通路激活剂包括:(1)ΡΙ3Κ信号通路激活剂I，30-100 μ M的PA，(2)ΡΙ3Κ信号通路激活剂II，250-500 μ g/mL的740Y-P ;溶液II的配制方法如下:L_15培养液为母液，还含有人血清白蛋白1wt.%。
[0022]上述非诊断治疗目的原始卵泡体外激活试剂盒的应用方法，步骤如下:1)取卵巢皮质于5mL溶液II，将卵巢皮质切割成Imm3的小块，用溶液II反复清洗；2)取ImL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活细胞培养液；3)将卵巢皮质培养于含有悬浮小网的24-孔板,在小网下方加入400 μ L激活细胞培养液,培养24小时，培养条件为37°C，5% CO2 ；4) 24h后，取ImL溶液I与试剂II混合，待试剂II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活细胞培养液；5)将培养板中的培养液吸干，加入新配置的激活培养液，继续培养24小时，培养条件为37°C，5% CO2 ；6) 24小时后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
[0023]有益效果:综上，应用mTOR和PI3K信号通路激活剂组成的原始卵泡体外激活试剂盒处理小鼠或人卵巢皮质，可以激活组织中的原始卵泡并促进卵泡的发育。在体外激活完毕的卵巢皮质，经过外科植入术，可以重新移植回母体，继续正常的发育，直到发育成熟，因此本发明提供了一种mTOR信号通路激活剂，同时提供了一种可供体外培养操作用的试剂盒，以使该技术应用于更大的医学辅助生殖领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1A为小鼠卵巢用mTOR信号通路激活剂处理24h后，收集卵巢组织通过western-blot的方法检测mTOR信号通路激活后的下游标志分子S6K1和rps6的磷酸化变化。p-S6Kl, p-rps6 为憐酸化的 S6K1 和 rps6。
[0025]图1B为新生小鼠卵巢应用mTOR信号通路激活剂处理24小时后，磷酸化rps6在新生小鼠卵巢中的表达。箭头，存在于原始卵泡卵母细胞中的阳性信号。标尺=100μπι。
[0026]图1C为激活后的卵巢皮质移植入受体小鼠肾被膜下14天后，可以促进卵巢的发育示意图。C为对照未处理卵巢；PA，PR0，mT0R激活剂PA和PRO处理的卵巢。标尺=1mm。
[0027]图1D为卵巢连续切片卵泡计数结果示意图。原始，原始卵泡；初级，初级卵泡；次级，次级卵泡；有腔，早期有腔卵泡；大有腔，大有腔卵泡。*，P〈0.05，差异显著；**，P〈0.01，差异极显著。
[0028]图2体外激活处理并不影响卵母细胞的质量。卵巢移植后18天，受体鼠一次性腹腔注射hCG促进排卵，收集卵巢，通过针刺排卵卵泡的方法收集卵子。其中一部分卵子进行体外受精评价胚胎发育情况，一部分卵子和受精卵进行固定及免疫荧光分析。a:收集的MII成熟卵子；b:MII卵子tubulin免疫荧光结果，视野中长条状为tubulin标记的纺锤体，长条状中心为Hoechst33258染色，标记细胞核；c:MII卵子5MeC免疫荧光结果，视野边缘为5MeC染色,标记卵母细胞的甲基化水平，中心为细胞核；d:体外受精1h后,雌雄原核形成的受精卵。偏离视野中心的为5MeC染色，标记处于甲基化状态的雌原核，视野中心为Hoechst33258染色，标记细胞核，可见受精卵中的雌雄原核，雄原核呈去甲基化状态，5MeC染色阴性。e:2细胞胚胎；f:囊胚；g:将2细胞进行胚胎移植后生产的健康后代。
[0029] 图3为PI3K信号通路激活剂单独处理能够激活新生小鼠卵巢中的原始卵泡示意图。A)小鼠卵巢原始卵泡体外激活培养48小时后卵巢的发育。小鼠卵巢用PI3K激活剂激活并培养48小时后，将卵巢固定并进行标志分子的免疫组化检测。左侧(a，c，e)为对照，右侧(b，d，f)为激活后的卵巢。a，b为F0X03的免疫组化结果，图中箭头所指为激活后的原始卵泡，F0X03的染色由细胞核(见对照)转移至细胞浆。c，d为BrdU的染色结果表明，激活后的卵巢组织中大量的细胞处于增殖状态。e，f为AMH的免疫组化结果表明，激活后的卵巢在培养48小时后，相较于对照组卵巢，有更多的卵泡进入次级卵泡阶段。B)将培养过的卵巢进行小鼠肾被膜下移植后14天卵巢的生长情况示意图。在每张图片中上层是对照组卵巢，下层是激活后的卵巢，代表不同的处理组。
[0030]图4为mTOR与PI3K信号通路激活剂协同作用促进新生小鼠卵巢的发育示意图。新生小鼠的一侧卵巢经过不同组合的mTOR与PI3K激活剂处理，另一侧卵巢应用mTOR或PI3K激活剂单独处理后，移植于同一受体小鼠的左右两侧肾被膜下发育14天。14天后，将移植的卵巢取出，观察卵巢的发育情况。
[0031]图5A为人卵巢组织经mTOR或PI3K信号通路激活剂处理并体外培养6天后卵泡的发育情况。a和b，培养前卵巢皮质中的原始卵泡，b为a的高倍镜(20X)下图片；c和d，对照组卵巢皮质中处于向初级卵泡转化的卵泡；e和f，mTOR信号通路激活剂处理卵巢皮质中成簇存在的次级卵泡，e为低倍镜(1X)的图片，f为高倍镜(20X)下不同视野的图片；g，PI3K信号通路激活剂处理后卵巢皮质中代表性的次级卵泡；h，mTOR与PI3K激活剂联合应用后卵巢皮质中代表性的次级卵泡。标尺=100 μ m。
[0032]图5B为培养6天后，培养卵泡的细胞增殖示意图。a和b，对照组的卵巢组织；(:和d，mTOR与PI3K激活剂联合应用后卵巢皮质山和山为高倍镜(20X)并且来自不同的视野。棕色标记为BrdU标记的处于增殖期的细胞核。
[0033]图5C为卵泡计数结果的统计学分析示意图。对照组，空白处理；处理l，mT0R信号通路激活剂处理组；处理2，PI3K信号通路激活剂处理组；处理3，mTOR激活剂与PI3K激活剂联合应用处理组；原始，原始卵泡；初级，初级卵泡；次级，次级卵泡；退化，退化的卵泡。*，P<0.05，#，P<0 .01，差异极显著。
[0034]图5A~C显示mTOR与PI3K信号通路激活剂协同作用促进人原始卵泡的激活和发育。人卵巢皮质分别应用mTOR、PI3K激活剂单独和联合处理，处理后卵巢皮质继续培养至第6天，收集卵巢皮质进行分析。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
[0036]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0037]实施例1
[0038]原始卵泡体外激活试剂盒,包括以下组分:
[0039]其中，溶液I配制方法如下:
[0040]基本激活细胞培养液:MEMa(GIBC0? Minimum Essential Medium (MEM) AlphaMedium(IX) liquid, Invitrogen)为母液,还含有人血清白蛋白10wt.%、丙酮酸钠0.23mM、L-抗坏血酸(维生素C) 50 μ g/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L ；
[0041]其中，试剂I配制方法如下:
[0042]mTOR信号通路激活剂I和II，含有200 μ M的PA和50 μ M的propranolol，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
[0043]其中，试剂II配制方法如下:
[0044]PI3K信号通路激活剂III和IV，含有30-100 μ M的bpV和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
[0045]其中，溶液II的配制方法入下:
[0046]L-15 (GIBCO, Invitrogen)和人血清白蛋白的混合液,其中人血清白蛋白占溶液11 体系 1wt.% ；
[0047]将这三种溶液分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的原始卵泡体外激活方法进行操作。
[0048]试剂盒使用方法如下:
[0049]I)取小鼠卵巢于5mL溶液II中，用溶液II反复清洗三次以上。
[0050]2)取ImL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配置成1mL的激活细胞培养液。
[0051]3)将小鼠卵巢培养于含有悬浮小网(Millicell cell culture inserts,Millipore)的24-孔板，在小网下方加入400 μ L激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为 37°C，5% C02。
[0052]4) 24h后，取ImL溶液I与试剂II混合，待试剂II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活细胞培养液；
[0053]5)将培养板中的培养液吸干,加入新配置的激活培养液，继续培养24小时,培养条件为 37°C，5% CO2 ；
[0054]6)24小时后，激活过程完成，将处理过的小鼠卵巢移植于受体小鼠的肾包囊下，并同时将受体小鼠的双侧卵巢摘除。
[0055]7)术后第二天，受体小鼠给予促卵泡素(FSH1IU/只)注射，连续18天。
[0056]8)在最后一天，给予受体小鼠1IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)处理。24小时后，收集移植的卵巢，通过针刺方法，释放发育成熟的卵子。
[0057]9)将卵子与来自于同一品系的公鼠精子进行体外受精后，将发育到的2细胞胚胎移植于假孕小鼠，并成功建立妊娠。最后统计经过体外激活试剂盒处理后的卵巢得到的成熟卵子其受精率和产仔数与正常成年卵巢经超数排卵得到的成熟卵子的区别。
[0058]实验结果见表1，表1为正常超排卵子与体外激活卵子体外受精后2细胞的胚胎发育率以及胚胎移植后成活率的比较。
[0059]从表1的结果可以看出，处理组的成熟卵子经体外受精后，2-细胞胚胎的发育率为64.3 %，而超排卵子的2-细胞胚胎发育率为86.7%，因此，在2-细胞胚胎发育率，处理组的卵子低于超排卵子。将2细胞胚胎经胚胎移植后，在产仔数方面，这两种卵子却几乎没有区别。因此，应用原始卵泡体外激活试剂盒处理卵巢后，并不会影响卵母细胞的受精和胚胎发育过程。
[0060]表1
[0061]
【权利要求】
1.原始卵泡激活剂，其特征在于由mTOR信号通路激活剂和PI3K信号通路激活剂组成，所述mTOR信号通路激活剂包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200 μ M磷脂酸，mTOR信号通路激活剂II为20-50 μ M普萘洛尔；所述ΡΙ3Κ信号通路激活剂包括ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，PI3K信号通路激活剂III为30-100 μ M的bpV，PI3K信号通路激活剂IV为250-500 μ g/mL的740Y-P。
2.根据权利要求1所述原始卵泡激活剂，其特征在于所述磷脂酸为200μ Μ，普萘洛尔为 50 μ Μ，所述 bpV 为 30 μ M，740Υ-Ρ 为 250 μ g/mL。
3.权利要求1或2所述原始卵泡激活剂在制备激活原始卵泡并促进卵泡发育药物中的应用。
4.原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于，包括以下组分: DmTOR信号通路激活剂I和II ; 2)PI3K信号通路激活剂III和IV ; 3)基本激活细胞培养液； 4)L-15培养液。
5.根据权利要求4所述的原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于mTOR信号通路激活剂I为磷脂酸，其浓度为:50-200 μ M ;mT0R信号通路激活剂II为普萘洛尔，其浓度为:20-50 μ M ； ΡΙ3 Κ信号通路激活剂III为bpV，其浓度为30-100 μ M ； ΡΙ3Κ信号通路激活剂IV为740Υ-Ρ，其浓度为250-500 μ g/mL ;基本激活细胞培养液配方=MEMa为母液，内含丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10 wt.%、L_抗坏血酸50 μ g/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L0
6.根据权利要求5所述的原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于，试剂组成为: 溶液1:基本激活细胞培养液； 溶液II:L-15培养液为母液，内含人血清白蛋白10 Wt.%; 试剂1:mT0R信号通路激活剂I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛尔，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量分别预先分装； 试剂II:ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，含有30-100 μ M的的bpV和250-500 μ g/mL的的740Y-P，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量分别预先分装。
7.根据权利要求5所述的原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于，试剂组成为: 溶液1:基本激活细胞培养液； 溶液II:L-15培养液为母液，内含人血清白蛋白10 Wt.%; 试剂1:预混在一起的mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛尔，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装； 试剂I1:预混在一起的ΡΙ3Κ信号通路激活剂III和IV，含有30-100 μ M的PA和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装。
8.根据权利要求6或7所述的原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于将溶液1、试剂1、试剂I1、溶液II分别包装，再一同包装在同一包装盒内。
9.权利要求6或7所述原始卵泡体外激活试剂盒的制备方法，其特征在于溶液1:基本激活细胞培养液配制方法如下=MEMa为母液，含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗坏血酸50 μ g/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L ;所述试剂I含有mTOR信号通路激活剂包括:(1) mTOR信号通路激活剂I，50-200 μ M的磷脂酸，(2) mTOR信号通路激活剂II，20-50 μ M的普萘洛尔；所述试剂II含有ΡΙ3Κ信号通路激活剂包括:(1) ΡΙ3Κ信号通路激活剂I，30-100 μ M的PA，(2) ΡΙ3Κ信号通路激活剂II，250-500 μ g/mL的740Y-P ;溶液II的配制方法如下:L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白1wt.%。
10.权利要求6或7所述非诊断治疗目的原始卵泡体外激活试剂盒的应用方法，其特征在于步骤如下: 1)取卵巢皮质于5mL溶液II，将卵巢皮质切割成Imm3的小块，用溶液II反复清洗； 2)取1mL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活细胞培养液； 3)将卵巢皮质培养于含有悬浮小网的24-孔板，在小网下方加入400μ L激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为37°C，5%C02 ； 4)24h后，取ImL溶液I与试剂II混合，待试剂II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活细胞培养液； 5)将培养板中的培养 液吸干，加入新配置的激活培养液，继续培养24小时，培养条件为 37°C，5%C02 ； 6)24小时后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
【文档编号】C12N5/075GK104130972SQ201410326486
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】李晶, 张婧, 何元林, 孙昕卉 申请人:南京医科大学