一株高产尼莫克汀的产色链霉菌及其筛选方法
【专利摘要】一株高产尼莫克汀的产色链霉菌，分类名称为产色链霉菌(Streptomyces?cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC?No.6217，保藏日期为2012年6月14日。本发明还提供了一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，包括下述步骤：a、出发菌株斜面培养；b、制备孢子液；c、紫外线诱变筛选；d、斜面培养；e、种瓶培养；f、对照菌液的制备；g发酵摇瓶筛选；h菌株复试；i、稳定性考察。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高大环内酯类抗生素产量的方法，具体涉及一株高产尼莫克汀 的产色链霉菌及其筛选方法。 一株高产尼莫克汀的产色链霉菌及其筛选方法
【背景技术】
[0002] 尼莫克汀是由产色链霉菌或者蓝灰链霉菌发酵产生的一种十六元环大环内酯类 抗生素，它主要用于合成亲脂性更强的莫西克汀。从结构上来看，尼莫克汀属于大环内酯类 抗生素，这类聚酮结构物质的生物合成过程呈现相似的规律，它是由7个乙酸盐单位，6个 丙酸盐单位和一个2-甲基丙酸盐单位，通过聚酮体（多聚乙酰）途径不断缩合而成。构成 尼莫克汀的原子全部来源于糖代谢后产生的支链脂肪酸、乙酸盐及丙酸盐，乙酸钠为尼莫 克汀的一种前体诱导物质，如果能够筛选到一株能够耐受高浓度乙酸钠的突变株，且该突 变株能够直接利用乙酸钠做为合成前体诱导物，可以大幅提升尼莫克汀的产量，对尼莫克 汀的工业生产具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明为解决现有技术中的不足，发明了能够耐受高浓度乙酸钠的一株高产尼莫 克汀的产色链霉菌，而且本发明还提供了其筛选方法。
[0004] 本发明为实现其目的采用的技术方案是：
[0005] -株高产尼莫克汀的产色链霉菌，分类名称为产色链霉菌（Streptomyces cyanneorisens)DC18-〇l，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC No. 6217,保藏日期为2012年6月14日。
[0006] -种如所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，包括以下操作步 骤：
[0007] a、出发菌株斜面培养：以砂土管保藏的产色链霉菌为出发菌株，使用无菌接种针 蘸取少量砂土孢子，划线接种于试管斜面培养基中，于26-30?、30% -60%湿度条件下培 养96-144h，得到斜面菌种；
[0008] b、制备孢子液：用15_20mL无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成孢子液；
[0009] c、紫外线诱变筛选：取5mL步骤b制备的孢子液于灭菌的培养皿中，于波长 254nm、功率30W的紫外灯下30cm处垂直照射120s，照射后立即用无菌锡纸包住，避光静 置15min，使用无菌水将紫外线照射过的孢子液稀释至孢子液1(Γ 2-1(Γ8,取稀释后的孢子液 0. 1-0. 3mL涂布于含有乙酸钠浓度为0. 1-0. 5mg/L的固体培养基中，26-30°C、30%-60%湿 度条件下培养96-144h，得到成熟的单菌落；
[0010] d、斜面培养：将步骤c培养成熟的单菌落划线转接至斜面培养基中，于26-30°C、 30% -60%湿度条件下培养96-144h，得到斜面孢子；
[0011] e、种瓶培养：挖取2_5cm2步骤d制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于 26-30°C，220-240rpm震荡培养24-30h得到成熟种液；
[0012] f、对照菌液的制备：以砂土管保藏的的产色链霉菌为出发菌株，依次经过步骤a、 步骤b、步骤d、步骤e得到对照菌液；
[0013] g、发酵摇瓶筛选：以体积比2% -8%的接种量将步骤e制备的成熟种液转接至 含有的乙酸钠浓度为0. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养 240-288h，检测效价，以体积比2% -8%的接种量将步骤f制备的对照菌液接种至不含乙酸 钠的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，选取检测效价 高于对照菌液的斜面，向其中加入lmL无菌水，用接种针刮下斜面孢子，制成孢子悬液，吸 取0. 2mL孢子悬液至空白砂土管中，在-750_760mmHg柱条件下干燥4-6h后于2-8°C冰箱中 砂土保藏，得到保藏菌株；
[0014] h、菌株复试：取步骤g筛选的砂土保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于 26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96-144h ;挖取2-5cm2斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于26-30°C、220-240rpm震荡培养24-30h，得到复试菌株成熟种液；取出发菌株的砂土孢 子作相同处理，得到出发菌株成熟种液，以体积比2% -8%接种量将复试菌株成熟种液转 接至含有的乙酸钠浓度为0. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，以体积比2% -8%接种量将出 发菌株成熟种液转接至不含有乙酸钠的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养 240-288h，检测效价，并进行效价对比；
[0015] i、稳定性考察：取步骤g保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于26-30°C、 30% -60 %湿度条件下培养96-144h，得到成熟斜面孢子；将成熟斜面孢子再划线转接于 斜面培养基中，连续转接三次后挖取2-5cm 2斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30°C、 220-240rpm震荡培养24-30h得到成熟种液；以体积比2% -8%接种量将成熟种液转接至 含有的乙酸钠浓度为0. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养 240-288h，检测效价，判断斜面传三代后相较于一代斜面接入种瓶再接入发酵摇瓶后，摇瓶 效价的相对标准偏差。
[0016] 操作中所用斜面培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0.3-0. 5、麦芽糖 0. 1-0. 15、酵母膏或酵母粉0. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黄豆饼粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸 氢二钾(λ 01-0. 03、琼脂 1-2。
[0017] 操作中固体培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0. 3-0. 5、麦芽糖0. 1-0. 15、 酵母膏或酵母粉〇. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黄豆饼粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氢二钾 0· 01-0. 03、琼脂 1-2。
[0018] 操作中种瓶培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0. 5-2、糊精1-3、黄豆饼粉 1-2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸镁0. 05-0. 2、磷酸氢二钾0. 05-0. 2。
[0019] 操作中发酵培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖1-3、淀粉1-3、糊精3-5、乳 糖2-4、黄豆饼粉1-1. 5、棉籽饼粉0. 5-1、碳酸钙0. 3-0. 5。
[0020] 本发明的有益效果是：本发明为一株高产尼莫克汀的产色链霉菌，本发明方法是 一种操作简单、高效的提高产色链霉菌发酵生产尼莫克汀水平的方法，通过将高浓度乙酸 钠添加在固体培养基中，结合紫外诱变最终筛选出了一株能够耐受发酵摇瓶0. 2mg/L乙酸 钠的菌株，比出发菌株的尼莫克汀产量提高20%以上。
【具体实施方式】
[0021] 本发明为解决现有技术中的不足，发明了能够耐受高浓度乙酸钠的一株高产尼莫 克汀的产色链霉菌，而且本发明还提供了其筛选方法，下面结合具体实施例对本发明进一 步说明。
[0022] 具体实施例1，一株高产尼莫克汀的产色链霉菌，分类名称为产色链霉菌 (Streptomyces cyanneorisens) DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编 号为CGMCC No. 6217,保藏日期为2012年6月14日。
[0023] 0. lmg/L乙酸钠浓度紫外线诱变筛选
[0024] -株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，包括以下操作步骤：
[0025] a、出发菌株斜面培养：以砂土管保藏的的产色链霉菌为出发菌株，使用无菌接种 针蘸取少量砂土孢子，划线接种于试管斜面培养基中，于28°C、30% -60%湿度条件下培养 120h ；
[0026] b、制备孢子液：用15_20mL无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成孢子液；
[0027] c、紫外线诱变筛选：取5mL步骤b制备的孢子液于灭菌的培养皿中，于波长 254nm、功率30W的紫外灯下30cm处垂直照射0s、30s、60s、90s和120s，照射后立即用无菌 锡纸包住，避光静置15min，使用无菌水将紫外线照射过的孢子液稀释至孢子液1(Γ 2-1(Γ8， 依次取0. 2mL稀释后的孢子液涂布于含有的乙酸钠浓度为0. lmg/L的固体培养基中，28°C、 40%-50%湿度条件下培养12011，0-2411正置培养，24-12011倒置培养，以种液紫外照射0 8 为对照，统计致死率，结果见表1 ;
[0028] 表1.不同紫外线照射时间的致死率（1)
[0029]
【权利要求】
1. 一株高产尼莫克汀的产色链霉菌，其特征在于：分类名称为产色链霉菌 (Streptomyces cyanneorisens) DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编 号为CGMCC No. 6217,保藏日期为2012年6月14日。
2. 根据权利要求1所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于， 包括以下操作步骤： a、 出发菌株斜面培养：以砂土管保藏的产色链霉菌为出发菌株，使用无菌接种针蘸 取少量砂土孢子，划线接种于试管斜面培养基中，于26-30?、30% -60%湿度条件下培养 96-144h，得到斜面菌种； b、 制备孢子液：用15-20mL无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成孢子液； c、 紫外线诱变筛选：取5mL步骤b制备的孢子液于灭菌的培养皿中，于波长254nm、功 率30W的紫外灯下30cm处垂直照射120s，照射后立即用无菌锡纸包住，避光静置15min，使 用无菌水将紫外线照射过的孢子液稀释至孢子液1〇_ 2_1〇_8,取稀释后的孢子液〇. 1-0. 3mL 涂布于含有乙酸钠浓度为〇. 1-0. 5mg/L的固体培养基中，26-30°C、30% -60%湿度条件下 培养96-144h，得到成熟的单菌落； d、 斜面培养：将步骤c培养成熟的单菌落划线转接至斜面培养基中，于26-30°C、 30% -60%湿度条件下培养96-144h，得到斜面孢子； e、 种瓶培养：挖取2-5cm2步骤d制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30°C， 220-240rpm震荡培养24-30h得到成熟种液； f、 对照菌液的制备：以砂土管保藏的的产色链霉菌为出发菌株，依次经过步骤a、步骤 b、步骤d、步骤e得到对照菌液； g、 发酵摇瓶筛选：以体积比2% -8%的接种量将步骤e制备的成熟种液转接至含有的 乙酸钠浓度为〇. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养240-288h， 检测效价，以体积比2% -8%的接种量将步骤f制备的对照菌液接种至不含乙酸钠的发酵 培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，选取检测效价高于对照 菌液的斜面，向其中加入lmL无菌水，用接种针刮下斜面孢子，制成孢子悬液，吸取0. 2mL孢 子悬液至空白砂土管中，在-750-760mmHg柱条件下干燥4-6h后于2-8°C冰箱中砂土保藏， 得到保藏菌株； h、 菌株复试：取步骤g筛选的砂土保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于 26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96-144h ;挖取2-5cm2斜面孢子接种于种瓶培养基中， 于26-30°C、220-240rpm震荡培养24-30h，得到复试菌株成熟种液；取出发菌株的砂土孢 子作相同处理，得到出发菌株成熟种液，以体积比2% -8%接种量将复试菌株成熟种液转 接至含有的乙酸钠浓度为0. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，以体积比2% -8%接种量将出 发菌株成熟种液转接至不含有乙酸钠的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养 240-288h，检测效价，并进行效价对比； i、 稳定性考察：取步骤g保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于26-30°C、 30% -60%湿度条件下培养96-144h，得到成熟斜面孢子；将成熟斜面孢子再划线转接于 斜面培养基中，连续转接三次后挖取2-5cm 2斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30°C、 220-240印111震荡培养24-3011得到成熟种液 ；以体积比2(%-8(%接种量将成熟种液转接至 含有的乙酸钠浓度为0. 05-0. 2mg/L的发酵培养基中，于26-30°C、220-240rpm震荡培养 240-288h，检测效价，判断斜面传三代后相较于一代斜面接入种瓶再接入发酵摇瓶后，摇瓶 效价的相对标准偏差。
3. 根据权利要求2所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在 于：操作中所用斜面培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0. 3-0. 5、麦芽糖0. 1-0. 15、 酵母膏或酵母粉〇. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黄豆饼粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氢二钾 0· 01-0. 03、琼脂 1-2。
4. 根据权利要求2所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于： 操作中固体培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0. 3-0. 5、麦芽糖0. 1-0. 15、酵母膏或 酵母粉0. 3-0. 5、淀粉0. 4-0. 6、黄豆饼粉0. 4-0. 6、糊精0. 4-0. 6、磷酸氢二钾0. 01-0. 03、琼 脂 1-2。
5. 根据权利要求2所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于： 操作中种瓶培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖0. 5-2、糊精1-3、黄豆饼粉1-2、酵母 膏或酵母粉1-2、硫酸镁0. 05-0. 2、磷酸氢二钾0. 05-0. 2。
6. 根据权利要求2所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于： 操作中发酵培养基成分及用量（g/l〇〇mL)为：葡萄糖1-3、淀粉1-3、糊精3-5、乳糖2-4、黄 豆饼粉1-1. 5、棉籽饼粉0. 5-1、碳酸钙0. 3-0. 5。
【文档编号】C12N1/20GK104109648SQ201410327571
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】李明, 杨丽锋 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司