一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物检测试剂，以及这种检测试剂的制备方法，确切讲本发明涉及一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法。本发明的牛支原体抗体检测试剂由混合均匀的1份牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化绵羊红细胞（v/v）构成。本发明的牛支原体抗体检测试剂所用的P48重组表达的融合蛋白抗原基因序列为SEQID№1。本发明可真实地检测牛支原体抗体；具有保存时间长、致敏效价高、易于长时间保存，血凝效价高，以及操作简单、方便快速，且价格低廉，安全稳定，无毒性，无环境污染等优点。
【专利说明】一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物检测试剂，以及这种检测试剂的制备方法，确切讲本发明涉 及一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 牛支原体是感染牛的一种重要的致病性病原体，1961年Hale在美国首次从患乳 腺炎的牛乳中分离到该病原，1976年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前已证实牛支 原体除导致牛肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不 孕等多种疾病。自2008年以来，我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了以坏死性肺炎为 主要特征的"传染性牛支原体肺炎"疫情，发病率为50%-100%，病死率高达10%-50%，给 我国养牛业造成了巨大的经济损失。此后相继在我国甘肃、宁夏、青海、贵州、内蒙、湖北、重 庆、山东等省市均有临床诊断报道，危害严重。但遗憾的是，迄今这些报道大多为根据临床 表现和剖检变化做出的临诊报告，鲜见应用准确的实验室诊断技术。因此，本病在我国的实 际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺 乏有效的牛支原体检测的相关技术。
[0003] 目前存在的检测牛支原体的技术有：1.病原分离鉴定，但是牛支原体分离往往受 到临床应用抗生素的影响，分离困难，且分离用培养基营养要求高、分离物鉴定难度大、灵 敏度低，不能作为早期快速诊断牛支原体感染的方法，也难以作为常规检测方法普及推 广（参见Caswell J L, Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cai:tle);2. PCR检测 方法（参见Thomas A, Dizier I, Linden A, et al . Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis),该检测方法需要对病料样品 进行较复杂的处理(研磨、离心、提取DNA等)，检测方法虽灵敏，但容易因污染和处理不当比 较容易出现假阳性，影响判定结果的准确性，此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，以 及较高成本，不适合临床或基层使用。3.间接ELISA是目前应用最主要的血清学检测方法， 国际上先后有用全菌蛋白包被和表达蛋白作为包被抗原的方法（出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France),全菌蛋白的方法特异性不足现已很少应用，表达蛋白抗原ELISA 方法目前已有商业化产品，但其所用哪一个抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法仅适合在 实验室进行检测，操作步骤相对复杂，需要专业人员进行操作，且需要一定的实验室条件和 仪器设备进行检测和分析结果。我们利用P48重组表达蛋白包被绵羊红细胞建立的间接血 凝检测方法，操作简单，无需特定的仪器设备，2~3小时即可判定结果，实验室检测和基层临 床均可应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决当前我国缺乏牛支原体抗体检测技术难题，提供一种牛 支原体抗体检测试剂及其制备方法，本发明同时提供用这种抗原制备间接血凝诊断试剂的 方法。
[0005] 本发明的牛支原体抗体检测试剂由混合均匀的1份牛支原体P48重组表达的融合 蛋白抗原和1份10%醒化-縣酸化绵羊红细胞（v/v)构成。
[0006] 本发明的牛支原体抗体检测试剂制备方法是： a. 将牛支原体p48基因合成到pet32a表达载体质粒中，得到阳性重组质粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重组质粒pet32a⑴-p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已转化到 BL21 (DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至0D值至0. 6左右，然后 吸取一定量的该菌液接种到的含氨苄青霉素的LB液体培养基诱导表达，收集菌体后过柱 纯化，得牛支原体P48融合蛋白； c. 用1份纯化的P48融合蛋白抗原与1份10%醒化-縣酸化绵羊红细胞（v/v)混合均 匀得到检测试剂。
[0007] 本发明的牛支原体抗体检测试剂中使用的牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗 原基因序列为SEQ ID Ns 1。
[0008] 本发明的优点包括以下方面：（1)本发明中抗原P48为牛支原体膜蛋白，具有很强 的特异性，能真实地检测牛支原体抗体；（2)用蛋白致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了 新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。（3)操作简 单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2?3小时内完成，适合在基层推广应用，可广 泛应用于牛支原体病流行病学的调查研究。（4)结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检 测牛支原体的抗体。（5)本发明的检测牛支原体抗体的诊断试剂，且价格低廉，安全稳定，无 毒性，无环境污染。（6)由于本发明中对P48基因进行了优化改造，使其可在感受态细胞中 高效表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1诱导温度37°C，lmmol/LIPTG浓度，重组菌(将阳性重组质粒pet32a⑴-p48 转化入表达菌BL21 (DE3)的阳性菌命名为重组菌)诱导表达6h，蛋白表达的电泳图，试验中 每孔上样均7uL，图中：泳道1为蛋白marker ;泳道2为未诱导表达菌；泳道3为诱导表达 菌；泳道4为诱导表达菌超声沉淀；泳道5为诱导表达菌诱导上清。
[0010] 图2优化表达条件：诱导温度16°C，0. lmmol/LIPTG浓度，重组菌诱导表达16h，蛋 白表达的电泳图，试验中每孔上样量均为7uL，图中：泳道1.诱导菌超声沉淀；泳道2.诱导 菌超声上清；泳道3.诱导表达菌；泳道4.未诱导表达菌；泳道5.蛋白maker。
【具体实施方式】
[0011] 本发明以下结合实施例进行详细解说。
[0012] 一、牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原的制备 a.牛支原体p48基因的合成及重组质粒鉴定 对已公开的牛支原体p48基因（Genebank: NC_014760. 1)密码子进行优化，按照密码子 在大肠杆菌的嗜好进行优化，同时将在牛支原体该序列中的4个表达色氨酸的TGA (UGA) 优化成TGG (UGG)，因为该密码子在大肠杆菌中为终止密码子，同时在其两端加上了酶切位 点BamH I和Xho I，经优化后的基因序列为SEQ ID Ns 1 ; 将优化后的p48基因序列交由Invitrogen公司合成到pet32a表达载体质粒中，合成 后，进行测序鉴定，酶切鉴定，将鉴定成功后的阳性重组质粒命名为Pet32_a (+) -p48。
[0013] b.牛支原体P48融合蛋白的可溶性表达 1. 1培养基配制 配制含氨苄青霉素的LB液体培养基2000ml。胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，氯化钠 200g，加入约1600ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加5N NaOH(约0. 4ml)，调节pH值至 7. 0。加入去离子水将培养基定容至2L，高温高压灭菌，待培养基放凉后，加入氨苄青霉素， 使其浓度达l〇〇ug/mL，放入4度保存备用。
[0014] 1.2P48蛋白的表达 首先，将带有目的基因的重组质粒pet32a (+) -p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑 取已转化到BL21 (DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于37°C摇床 中，220rpm震荡培养至0D600至0. 6左右，然后吸取一定量的该菌液接种到新的100倍体积 的含氨苄青霉素的LB液体培养基，在37°C时220rpm震荡培养，使用lmmol/L IPTG (IPTG 全称Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，中文名为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷） 浓度，诱导表达6小时后，收集菌体，将菌液6000rpm离心10min，弃上清，用0. 1倍菌液体积 的pH7. 2PBS将菌体重悬，并进行冰上超声破碎30min。然后将超声处理的液体置于离心机 中llOOOrpm离心30min，收集上清，沉淀用0. 1倍菌液体积的pH7. 2PBS重悬。同时设立不 加 IPTG的表达菌作为对照。将诱导表达菌、阴性对照菌的上清、沉淀分别取60uL样品，再 加入20uL4 X SDS上样buffer，煮沸8-10min，进行SDS-PAGE检测。结果如图1 :(每孔上样 量均为7uL) 将带有目的基因的重组质粒pet32a(+)-p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已 转化到BL21 (DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于37°C摇床中， 220rpm震荡培养至0D600至0. 6左右，然后吸取一定量的该菌液接种到新的100倍体积的 含氨苄青霉素的LB液体培养基，在16°C，0. lmmol/L IPTG浓度下诱导表达16h，收集菌体， 6000rpm离心10min，弃上清，用0. 1倍菌液体积的pH7. 2PBS将菌体重悬，并进行冰上超声 破碎30min。然后将超声处理的液体置于离心机中llOOOrpm离心30min，收集上清，沉淀用 〇. 1倍菌液体积的pH7. 2PBS重悬。同时设立不加 IPTG的表达菌作为对照。将诱导表达菌、 阴性对照菌的上清、沉淀分别取60uL样品，再加入20uL4X SDS上样buffer，煮沸8-10min， 进行SDS-PAGE检测。结果如图2 :(每孔上样量均为7uL) 图1的泳道2、图2的泳道4为不同诱导温度时不加 IPTG的对照组，由图可见，无 P48 蛋白的表达。由图2泳道3来看，在16°C、0. lmmol/LIPTG浓度、低温诱导表达16h时，P48 蛋白的表达量约占全菌蛋白的50%，而图1泳道3则显示在37°C、lmmol/LIPTG浓度、6小 时诱导表达，P48蛋白的表达量仅约占全菌蛋白的5% ;由超声破碎后蛋白电泳来看，即由图 1的泳道4、5以及图2的泳道1、2,可得结论在16°C、0. lmmol/LIPTG浓度、16h诱导表达， P48基本是以可溶性蛋白表达，可溶性表达量约占全菌可溶性蛋白的70%。经对比发现，在 16°C，0. lmmol/LIPTG浓度诱导表达16h时可以获得可溶性P48蛋白高效表达。
[0015] 因此，本发明具体实施时选用优化后的条件，即16°C，0. lmmol/LIPTG浓度诱导表 达16h以获得大量的可溶性P48蛋白。将带有目的基因的重组质粒pet32a(+)-p48转化到 感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已转化到BL21(DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液 体培养基中，放置于37°C摇床中，220rpm震荡培养至0D600至0. 6左右，然后吸取10ml的该 菌液接种到新的1000ml含氨苄青霉素的LB液体培养基，在16°C，0. lmmol/L IPTG浓度下诱 导表达16h，收集菌体，6000rpm离心lOmin，弃上清，用100ml体积的pH7. 2PBS将菌体重悬， 并进行冰上超声破碎30min。然后将超声处理的液体置于离心机中llOOOrpm离心30min， 弃去沉淀，收集上清液l〇〇ml。
[0016] c.牛支原体P48融合蛋白的纯化 柱子的制备：固定柱子，将颠倒混匀过的树脂悬浊液吸取5ml加入到固定好的空柱 子里，待树脂完全固定以后，取下塞子，流完里面的保存液以后向柱子中加入50ml的LE buffer平衡柱子； 将16°C诱导表达菌进行超声处理后制备好的100ml上清液用0. 45nm的滤膜过滤，将该 样品加入到已经平衡的柱子内； 用100ml的LE buffer冲洗柱子直到280nm处的吸光度为0 ; 用100ml (20倍体积）的wash buffer冲洗柱子； 用20ml的Elution buffer洗脱与树脂结合的蛋白，收集洗脱液，测其蛋白浓度为 1. 56ug/ul，保存备用。
[0017] 二、本发明检测试剂的制备 本发明的检测试剂是用上述制备的牛支原体P48融合蛋白抗原和致敏醛化-鞣酸化 绵羊红细胞制备，经相关的试验，本发明试剂中的抗原最佳致敏浓度为10 μ g/ml?20 μ g/ ml，其具体制备步骤如下： 取1份纯化的P48融合蛋白抗原与1份10%醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀，在 37°C水浴中作用50 min，其间不断搅拌；离心沉积红细胞，用含1%健康兔血清的0. 15mol/L pH7. 2 PBS洗涤三次后，配成1%致敏红细胞悬液，即为间接血凝诊断抗原，与配套试剂组装 成检测牛支原体抗体的间接血凝诊断试剂，包括：抗原1瓶，l〇ml/瓶；标准阳性血清1瓶， lml/瓶；标准阴性血清1瓶，lml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。
[0018] 检测时，先在96孔"V"型聚苯乙烯滴定板8行12列上每孔滴加稀释液25μ L ; 然后在1~9列每列第1孔分别加入被检血清25 μ L，每份被检血清用1列，第10、11列第1 孔分别加入标准阳性血清、标准阴性血清各25μ L，第12列为空白对照。用排枪将1?11 列第1孔充分混匀后吸取25 μ L加入第2孔，依次连续稀释至第8孔，混匀后从第8孔弃去 25 μ L ;最后每孔滴加1%致敏红细胞悬液(诊断抗原）25 μ L，加样完毕将V型滴定板放在微 量震荡器上震荡lmin，盖上玻璃板，置37°C温箱2h，判定结果。
[0019] 判定标准：红细胞全部凝集（+ + + +) ;75%红细胞凝集（+ + +) ;50%红 细胞凝集（+ +) ;25%红细胞凝集（+);无凝集（一）。阳性血清对照1?8孔应呈现 " + + + +?+ + "凝集；阴性血清和空白对照应呈现"一"。在对照孔合格的前提下，观察待 检血清各孔。以呈现" + + "凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。效价: 8 ( + + )判为阳性，效价: 4 ( + + )判为阴性。效价介于两者之间判为可疑，需重新测 定，仍为可疑判为阳性。
[0020] 三、检测与试验 1.特异性试验 用本发明中的牛支原体抗体检测间接血凝诊断试剂，对健康牛血清、牛生殖道支原体 阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、牛肺疫阳性血清、无乳支原体阳性血清进行检测，结果 均为阴性(参见表1 )，说明该抗原具有极高的特异性。 表1牛支ilftfi]接血S诊试苟特弊性试验结果·
【权利要求】
1. 一种由混合均匀的1份牛支原体P48融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化绵羊红 细胞（v/v)构成。
2. 权利要求1所述的牛支原体抗体检测试剂制备方法，其特征在于： a. 将牛支原体p48基因合成到pet32a表达载体质粒中，得到阳性重组质粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重组质粒pet32a⑴-p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已转化到 BL21 (DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD值至0. 6左右，然后 吸取一定量的该菌液接种到的含氨苄青霉素的LB液体培养基诱导表达，收集菌体后过柱 纯化，得牛支原体P48融合蛋白； c. 用1份纯化的P48融合蛋白抗原与1份10%醒化-縣酸化绵羊红细胞（v/v)混合均 匀得到检测试剂。
3. 权利要求1所述的牛支原体抗体检测试剂中使用的牛支原体P48重组表达的融合 蛋白抗原基因序列为SEQ ID Ns 1。
【文档编号】C12N15/31GK104062439SQ201410327648
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】储岳峰, 逯忠新, 简莹娜, 赵萍, 贺英, 陈胜利, 刘永生 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所