鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用。本发明将分离得到的传染性支气管炎病毒野生强毒株进行鸡胚适应驯化，获得了高度适应鸡胚且保持良好遗传特性和免疫原性的传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为ck/CH/LLN101135。将其灭活后，进行免疫效力评价实验，结果表明，由本发明的疫苗株制备得到的传染性支气管炎灭活疫苗能够激发机体产生良好的免疫反应，同时显著提升鸡的主动免疫保护效力，对传染性支气管炎强毒的感染起到有效保护作用。本发明涉及的传染性支气管炎病毒疫苗株可应用于制备成鸡传染性支气管炎灭活单苗或联苗等。
【专利说明】鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒疫苗株，尤其涉及鸡传染性支气管炎的病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用，本发明属于鸡传染性支气管炎的防治领域。
【背景技术】
[0002]鸡传染性支气管炎(Avian Infect1us Bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infect1us Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是:病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。鸡传染性支气管炎自1930年以来在世界各国普遍流行，造成了较大的经济损失。随着病毒的传播和遗传演化，目前IBV存在多个血清型。
[0003]目前中国大部分地区流行IBV，而且在中国免疫鸡群和非免疫鸡群中均有新型肾致病性IBV在流行。该病作为严重危害我国养鸡业的重大传染病之一，近年来该病原普遍出现许多新的变异株，给我国养殖业带来了新的威胁。为了有效防治该病，有必要研究新型疫苗，现阶段其常规疫苗是世界各国广泛使用的M41血清型的灭活苗或其鸡胚适应弱毒苗H120和H52。但是由于目前IBV血清型众多，现有疫苗均只能提供部分保护或无保护，而IB弱毒疫苗致弱程度难以掌握，可有一定的致病性和传播能力，甚至可能在感染的机体中引起持续的潜伏感染，成为突变的主体或重组变异的供体，加上疫苗的运输、贮存和使用等条件要求较高，使得致弱活毒疫苗在理论上和实践上都不可能从根本上彻底控制IB的流行。
[0004]灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。目前国内大量应用的M41灭活疫苗在以往的生产中发挥了重要作用，然而，随着我国IB流行态势的复杂化，该灭活疫苗毒株血清型与新的流行毒株已经不能完全匹配，导致传染性支气管炎在免疫鸡群中普遍发生。
[0005]因此，研制对我国流行毒株针对性强的灭活疫苗与相应的活疫苗综合应用迫在眉睫。本发明正是基于以上形势，利用现有研究基础，将筛选并培育的新型鸡传染性支气管炎疫苗株制备成安全、高效的新型疫苗，研究表明，该新型灭活疫苗能够有效抵抗目前我国主要流行传染性支气管炎野毒株的攻击，对于有效控制鸡传染性支气管炎疫病的持续暴发和流行具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是克服现有鸡传染性支气管炎灭活疫苗株M41(病毒纤突蛋白(SI)遗传进化关系上与Massachusetts相近，本领域技术人员将其归纳为Mass型鸡传染性支气管炎毒株)不能够有效防制鸡传染性支气管炎(Avian Infect1usBronchitis, IB)流行毒株的攻击，IB的防治效果不理想等缺陷，提供一株新的鸡传染性支气管炎疫苗株(病毒纤突蛋白(SI)遗传进化关系上与LX4株或QX株相近,本领域技术人员将其归纳为LX4型(QX样)毒株)，该疫苗株能够有效抵抗目前我国主要流行传染性支气管炎野毒株的攻击，可提供良好的免疫保护效力。
[0007]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的:
[0008]本发明将从我国流行的传染性支气管炎流行毒株中筛选出具有典型代表性且经灭活后具有良好抗原性的LX4型(QX样)鸡传染性支气管炎疫苗株，其形态学观察:病毒株尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，毒病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。
[0009]本发明的一种鸡传染性支气管炎疫苗株，命名为ck/CH/LLN101135，分类命名为传染性支气管炎病毒Infect1us bronchitis virus,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年2月21日，其微生物保藏号是=CGMCC N0.8790。
[0010]本发明所涉及的传染性支气管炎疫苗株ck/CH/LLN101135株其病毒纤突蛋白亚基Si基因序列进化关系分类如附图1所示。SI基因是传染性支气管炎病毒的主要保护性基因，能够刺激机体产生中和抗体，SI基因也是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，且其高变区主要位于SI基因内，因此本发明主要展示本发明涉及毒株的SI基因序列，本发明疫苗株所具有的纤突蛋白SI亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，由SEQ ID NO: 2编码。纤突蛋白亚基SI基因与SEQ ID N0:2所示序列相比具有95%以上的同源性，且与本发明的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株ck/CH/LLN101135株具有相同或相似免疫效力的病毒株或是本发明所述疫苗株ck/CH/LLN101135株的SI基因突变株，只要突变后的纤突蛋白亚基SI基因与SEQ ID N0:2所示序列相比具有95%以上的同源性就仍落在本发明的保护范围之内。本发明涉及的LX4型(QX样)疫苗株可在鸡胚或鸡体内持续增殖进化，本领域技术人员可通过分离培育的毒株将SI基因与LX4型(QX样)毒株的SI基因进行对比，可发现本发明涉及的LX4型(QX样)疫苗毒株在SI遗传进化关系上的特征。
[0011]将本发明的一种鸡传染性支气管炎疫苗株ck/CH/LLN101135株灭活后，进行免疫效力评价实验，结果表明，本发明的ck/CH/LLN101135疫苗株经灭活剂灭活处理后仍能保持良好的免疫原性，接种于经Mass型传染性支气管炎活疫苗H120基础免疫的鸡能够显著提升针对LX4型(QX样)病毒的中和抗体水平，其中10只ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度较10只Mass型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量不少于6只，且ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于Mass型疫苗株H120基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度，说明本发明涉及的ck/CH/LLN101135株疫苗毒株对鸡传染性支气管炎保护性抗体具有良好的提升效力。同时，ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡和Mass型疫苗株H120基础免疫鸡用LX4型(QX样)强毒攻击后，ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体(针对LX4型(QX样)毒株)滴度和Mass型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度差异同样显著，其中10只ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度较10只Mass型活疫苗H120基础免疫鸡的血清中和抗体滴度高2倍以上的鸡数量不少于7只，且ck/CH/LLN101135株灭活疫苗加强免疫鸡的血清中和抗体滴度均高于Mass型疫苗株H120基础免疫对照鸡的平均血清中和抗体滴度，说明本发明涉及的ck/CH/LLN101135株疫苗毒株对鸡传染性支气管炎保护性抗体具有良好的提升效力。安全性试验结果表明，本发明涉及的LX4型(QX样)鸡传染性支气管炎灭活疫苗对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。
[0012]本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株在制备鸡传染性支气管炎灭活疫苗中的应用。
[0013]本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种防治鸡传染性支气管炎(LX4型(QX样))的疫苗组合物，其由灭活后的本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株(命名为ck/CH/LLN101135株)和药物学上可接受的免疫佐剂组成。
[0014]本发明所述的一种防治鸡传染性支气管炎(LX4型(QX样))的疫苗组合物可参考以下方法制备得到:(1)将本发明涉及的疫苗株ck/CH/LLN101135株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养，收获病毒尿囊液；(2)经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液加入灭活剂进行灭活处理，制备抗原；(3)经灭活检验合格的抗原与佐剂进行乳化，制备成LX4型(QX样)传染性支气管炎灭活疫苗。
[0015]本发明涉及的LX4型(QX样)鸡传染性支气管炎灭活疫苗的使用方法:
[0016](I)接种途径:肌肉或皮下接种。
[0017](2)接种剂量:1 羽份(0.3-0.8ml)。
[0018]本发明LX4型(QX样)鸡传染性支气管炎灭活疫苗免疫后20天产生免疫力，一次免疫持续期为4个月。本发明LX4型(QX样)毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1本发明ck/CH/LLN101135株疫苗株与参考毒株基于病毒纤突蛋白SI基因的遗传进化关系图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0021]实施例1鸡传染性支气管毒株ck/CH/LLN101135的分离鉴定
[0022]1、材料和方法
[0023]1.1现地样品和病毒分离:在我们对IBV进行持续的流行病学监测过程中，从我国各地疑似IB感染的养殖场鸡群收集肾脏样品，发病鸡表现呼吸道病的早期临床症状，包括喘气、咳嗽、打喷嚏和气管啰音。死亡鸡进行剖检，可见不同程度的气管炎、肾炎和腺胃炎，蛋鸡群主要表现死亡、产蛋下降以及产畸形蛋。本研究收集的样品来源于免疫过Mass型商品化弱毒疫苗的鸡群。
[0024]病毒分离时，将样品研磨混悬于0.1 %的PBS缓冲液，于4°C经1500g离心1min后将上清通过0.22 μ m的过滤膜进行过滤，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种后将胚置于37°C孵育，每天照胚，经过3-5次盲传直到鸡胚培养2-7天出现侏儒胚，发育障碍、卷曲胚等特征性病变。
[0025]1.2电镜观察:样品接种鸡胚后出现典型病变，将尿囊液处理后进行电镜观察，将1.5ml尿囊液经过低速1500g离心30min后，上清以12000g离心30min,取上清,用少许去离子水将离心后的沉淀重悬，通过负染法染色在电镜下进行观察。
[0026]1.3 IBV疫苗和毒株:商品化Mass型疫苗H120用于免疫攻毒保护试验，按照说明书点眼途径进行接种。本研究分离的LX4型(QX样)代表株ck/CH/LLN101135株用于免疫保护评价试验，通过Reed-Muench法测定和计算病毒滴度，接种鸡前将病毒稀释至104 8EID50/100微升，100微升/只鸡进行接种。
[0027]1.4 IBV分离株SI基因的克隆和序列测定:利用DNAStar软件的MEGALIGN程序对分离株和参考毒株的SI基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行对比和分析，利用DNAStar软件的Clustal V方法对SI基因核苷酸序列进行遗传进化分析，本研究选择的参考毒株用于遗传进化分析，这些毒株代表了我国1997年-2011年期间不同时间和不同地区的毒株以及部分国外流行的LX4型(QX样)IBV毒株。
[0028]1.5动物实验设计:以一株LX4型(QX样)IBV代表毒株ck/CH/LLN101135株为例，60只I日龄SPF鸡分为4组，分别饲养于单独的负压隔离器，第1-2组每组20只鸡，第3和4组每组10只。第1、3组在I日龄根据疫苗说明书接种H120疫苗；第2、4组鸡接种无菌的空白尿囊液；其中第I组和第2组在20日龄时滴鼻攻击LX4型(QX样)IBV代表毒株ck/CH/LLN101135株，第3组和第4组分别以相同途经接种无菌的空白尿囊液。
[0029]1.6动物实验样品采集:第1、2组在攻毒后5天每组取10只鸡捕杀，第3组和第4组分别取5只捕杀，采集捕杀鸡的气管和肾脏，分别单独处理置于300微升的病毒分离液(50%甘油，50% PBS)中，保存于_20°C条件下以备病毒分离，每组剩余鸡进行临床观察，观察30天后捕杀进行剖检，免疫鸡在免疫后3，6，9，12，15和18天采血，分离血清并测定血清抗体，攻毒鸡攻毒后3，6，9，12和15天同样采血，分离血清进行抗体检测。
[0030]1.7动物实验样品中病毒的分离和RT-PCR鉴定:攻毒后采集的每只鸡样品均用于病毒分离 ，每个样品研磨后按10%比例加入0.1% PBS，先以1500g在4°C离心10min，上清经0.22 μ m的滤膜过滤后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，0.2ml/胚，每个样品接种3枚胚，接种后鸡胚置37°C继续孵育，每天照胚，每种样品接种后72小时取其中2枚胚尿囊液进行RT-PCR扩增，剩余鸡胚一周后观察胚体的特征性病变，如是否出现侏儒胚，发育停滞以及卷曲胚。经过1-3代盲传，鸡胚死亡或出现IB典型的特征性病变则判为样品IBV阳性。
[0031]为了确保判断的准确定，将接种鸡胚的尿囊液进行RT-PCR扩增鉴定，取200微升尿囊液用于RT-PCR扩增，抽提总RNA，利用N(-)引物进行反转录，引物N(-) and N(+)用来扩增包括大部分N基因和3’UTR部分区域在内的约1600bp大小的片段，扩增的PCR产物通过I %的琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0032]1.8抗体检测:将采集的血清样本利用IDEXX公司的商品化ELISA试剂盒进行检测，并根据试剂盒说明书计算血清抗体阳性比率。
[0033]2 结果
[0034]2.1病毒检测和分离结果:
[0035]从疑似IB感染的样品中分离到IBV病毒，对接种鸡胚后不同代次的尿囊液进行电镜观察，所有分离株均有冠状病毒粒子的典型形态特征，而且样品中无其他外源病毒存在。
[0036]本发明将分离得到的传染性支气管炎病毒野生强毒株进行鸡胚适应驯化，获得高度适应鸡胚且保持良好遗传特性和免疫原性的传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为ck/CH/LLNlOl 135株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年2月21日，其微生物保藏号是:CGMCC N0.8790。
[0037]2.2 IBV分离毒株的遗传进化分析:
[0038]通过对分离的IBV毒株ck/CH/LLN101135株和参考毒株的SI基因序列的遗传进化分析，表明我国分离毒株可分为5个不同的基因群或基因型，如附图1所示，分离的IBV毒株ck/CH/LLN101135株与已公开参考毒株LX4和QX株同属于一个基因型，该群毒株为我国主要流行毒株，主要包括我国1997年-2009年期间分离的毒株。并通过对比发现我国分离的LX4型(QX样)毒株与国外毒株相似性较高，表明不同国家流行的LX4型(QX样)毒株来源相似。
[0039]2.3动物实验临床观察结果:
[0040]试验鸡用病毒攻击后3天开始出现临床症状，表现羽毛蓬乱、不食或少食，但均不表现明显的呼吸道症状，对照鸡表现正常，攻毒鸡则精神不振，聚堆。攻毒后5天鸡群均发病，攻毒后5-7天，其中ck/CH/LLN101135株病毒攻击组死亡2_5只，死亡鸡解剖发现均出现肾脏肿大，苍白，输尿管和肾脏均有尿酸盐沉积，表明ck/CH/LLN101135株毒株为致肾脏病变型，同时还发现攻毒后死亡的SPF鸡盲肠扁桃体均有出血。但是在腺胃和输卵管均未观察到明显病变，发病期为攻毒后3-10天。
[0041]2.4 Mass型疫苗H120对分离毒的保护性:
[0042]虽然分离毒攻击H120免疫后的鸡均未发现死亡，但是部分免疫鸡出现临床症状，说明H120疫苗不能对分离的ck/CH/LLN101135株病毒提供完全保护。攻毒后5天采集样品进行病毒学检测，结果见表1。可见非免疫对照鸡的气管和肾脏均分离到病毒，而所有免疫H120的鸡在气管中也同样都分离到了病毒，在大多数免疫鸡的肾脏中也分离到病毒，说明用Mass型疫苗毒免疫不能对我国分离的ck/CH/LLN101135株毒株攻击提供对肾脏和气管的保护。
[0043]2.5血清学检测结果:
[0044]对免疫鸡和攻毒鸡在不同时间采集的血清进行检测，结果见表1。每组免疫鸡在H120免疫后6天均有I只鸡抗体未能转阳，免疫后15天所有H120免疫鸡的抗体均转阳性，从测定的结果来看，野毒感染的抗体转阳要早于疫苗毒免疫后抗体转阳的时间，这也进一步反应ck/CH/LLN101135株毒株免疫原性较强。
[0045]表1 ck/CH/LLN101135株攻毒后血清学反应及病毒分离结果
[0046]
【权利要求】
1.鸡传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为ck/CH/LLN101135，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是=CGMCC N0.8790。
2.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株在制备鸡传染性支气管炎灭活疫苗中的应用。
3.一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，其特征在于由灭活后的权利要求1所述的鸡传染性支 气管炎病毒疫苗株和药学上可接受的免疫佐剂组成。
【文档编号】C12N7/00GK104130981SQ201410327912
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】刘胜旺, 韩宗玺, 邵昱昊, 孔宪刚 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所