一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用。包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌P1启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌ccdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega?leader序列，所述的Omega?leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。本发明的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。
【专利说明】一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于微藻基因工程领域，具体涉及一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用。
【背景技术】
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[0002]传统能源的不可再生性决定了其日益枯竭的趋势，且造成环境问题日益严重。能源危机和环境污染的日益严峻激起了人们的能源忧患意识及污染物零排放观念，加强了对废油脂及工业下脚料的回收处理及科学利用，推动清洁新型能源的开发利用。寻求一种安全可靠的、清洁的可再生能源已成为当今世界共同关注的焦点。生物能源是指利用生物可再生原料及太阳能生产的能源，包括生物质能生物液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生物柴油、生物质气化及液化燃料、生物制氢等(谭天伟，等，2003)。其中，生物柴油是采用来自动物或植物脂肪酸单酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等与甲醇(或乙醇)经酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲(乙)酯，是一种可以替代普通石油柴油的可再生的清洁燃料，相较于其它种类的生物能源，生物柴油具有原料广泛、生产高效、环境友好、净化环境等突出特点(谭天伟，等，2002)。
[0003]Chisti通过建立数学模型和工程计算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007 ；Chisti, et al.，2008)。因具有清洁、高效、环保、产油量大等优点，微藻生物能源被视为最具有发展潜力的生物柴油的资源(Metting，etal., 1996 ；Spolaore, et al.，2006 ；ffeers, et al.，1977 ；Hu et al., 2008)。娃藻是海洋浮游生物最重要的组成成分，在提供海洋初级生产力方面发挥着重要的作用。它们是研究发现新颖的在其他经常研究的生物体中不存在的代谢路径的主要研究对象，因为在它们进化过程中形成一系列新颖的代谢路径(Armbrust, et al.，2004)。由于三角褐指藻具有生长周期短、生长快、脂质含量高等优点，成为最具潜力的产油微藻(Yang, et al.，2013 ；Niu, etal.，2012)。因此，通过遗传学改造提高三角褐指藻的脂质含量与生物量是提高工业化生产产量的重要途径。
[0004]海洋硅藻三角褐指藻，一种广泛使用的饵料藻，其快速增长和高脂肪含量已成为有吸引力和有前途的，作为生物柴油的新来源，它的基因组在2008年已被测序(http://genome, jg1-psf.0rg/Phatr2/Phatr2.home, html),使得它也成为研究功能基因组学一个模型微藻。
[0005]载体兀件是决定微藻表达系统中DNA表达稳定性的关键部件之一。随着基因组测序技术的快速进步，基因测通技术和序列信息注释已被开发用于传输序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各种的方法，如异位表达，基因沉默，蛋白质亚细胞定位，启动子活性分析，结构一功能分析，并在体内或体外用生物化学测定基因表达模式分析。然而，对基于限制性内切酶/连接酶克隆方法工程表达构建体的常规方法是非常费力和耗时的，并且经常受到限制性酶切位点的阻碍。在模型藻莱茵衣藻和三角褐指藻甚至大多数高等植物中载体构建是功能基因分析的主要障碍，因此，迫切需要创新和有效的技术手段克服以上困难。最近的通路克隆系统用两步骤的位点特异性重组快速大规模克隆研究一个或者多个基因进入载体(G andj, 2004)。需连入载体的DNA片段，首先克隆到一个普通供体载体。然后，由两个位点特异性重组位点(attBl和attB2位)中的供体质粒侧翼的DNA片段可以被精确地转印到各种表达载体中，通过位点特异性重组反应。一旦DNA产物被靶向到供体载体中，无需传统的限制性内切酶和连接酶克隆的简单反应。将重组克隆系统，DNA的转移构建体整合到表达目的载体所介导Gateway技术，和许多开放阅读框条目(供体)的克隆的集合和表达质粒已被广泛用于功能基因组学中的许多生物创建(Aliverti etal.，2008)。然而，在这种方式中使用的酶的成本相对昂贵，特别是相关技术几乎没有在硅藻三角褐指藻中报道，并且转化效率不高，因此通过利用选择标记基因构造微藻的遗传转化的零背景的TA克隆载体。此外，该技术可灵活地适应用于PCR扩增的基因或片段开发专门的表达载体的单步装配(Chen et al.，2009)。通过限制性内切酶XcmI的高效酶切，该质粒可以形成两个3’的T突出端以便用于TA克隆，我们这次构建的T载体基于限制性内切酶XcmI的灵活运用(Chen et al.，2009)，T载体连接方式几乎适用于所有的基因克隆连接工作，使得未来都省时省力连接目的基因到在三角褐指藻表达的载体。
[0006]用于遗传转化的关键步骤是有一个包含所有表达基因元件的载体，该载体包含选择标记(通常是抗生素抗性基因)的表达盒或者选择质粒在细菌或选择在宿主生物体中的基因转移，以及用于表达的宿主生物体中另一个靶基因表达盒的操作。然而，所生产的选择标记蛋白的获得转基因生物体后不想要的。构建生产转基因细胞异源蛋白质有时是有问题的，因为一些蛋白质可能会影响转基因细胞或细胞的生长，一个可行的选择是使用诱导型启动子来限制选择标记蛋白在转基因生物体的表达。诱导型启动子的发展也是必不可少的转化载体允许选择标记物的表达，以及是在细胞中表达感兴趣的基因的设计思路。
[0007]某些广泛用于植物转化的异源启动子已被用于在微藻的基因转化中。如在甲藻Amphidinium中，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和pI’2’农杆菌启动子启动了报告基因⑶S的表达(Leon and Fernandez, 2007)。然而，由于这些微细藻类的独特的核特性,异源启动子表达量的影响，而不是如预期在高等植物中表达量高，在藻类中表现出相对低的表达水平，且通常为瞬时表达。与此相对，单细胞绿藻莱茵衣藻的RBCS2启动子比在转基因盐藻中使用35S启动子表现出更高的效率(Sun et al.，2005)。在羽状娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻海链藻(Poulsen and Kriigcr.2005)中用内源的岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白(fcp)启动子和硝酸还原酶(NR)启动子呈现相对较高的转化效率(Poulsenet al.，2006)。从娃藻Cylindrotheca fusiformis中克隆的启动子在娃藻三角褐指藻中呈现相对较高效率的表达(Miyagawa et al.，2009)。此外和羽状娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻Thalass1sira pseudonana相比，三角褐指藻遗传转化方法的技术限制，其转换效率都比较低。因此，新型和有效的内源性启动子的功能研究是外源基因在三角褐指藻高效表达的重要因素。
[0008]绿色荧光蛋白是真核细胞中基因表达的定量基因(Soboleski，2004)。含绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的质粒DNA可通过蛋白免疫印迹法和细胞荧光来检测该蛋白质的表达(Tolonen et al.，2006)。Scott等人已成功将绿色突光蛋白报告基因在衣藻Chlamydomonas reinhardtii 叶绿体中表达(Scott Franklin, 2002)。Li 等人在转基因盐藻成功表达硝酸还原酶诱导的绿色突光蛋白表达(Li et al.，2007)。Niu等人在三角褐指藻中成功建立诱导表达绿色荧光蛋白表达系统(Niu et al.，2012)。
[0009]目前微生物油脂的高额生产成本阻碍了其大规模产业化.提高产油微生物中的油脂含量是解决成本问题的一个关键。然而，无论是在微生物还是植物中，油脂含量的提高都是一个具有较大难度的工作。研究者曾采取各种各样的方法，包括基因修饰等方法来去除可能对油脂积累有阻碍作用的物质，但这些尝试都失败了，或者说油脂产量的提高不显著(10%~15% ) (Rafledge et al.2010)。近年来研究证实，油脂积累期间6_磷酸葡萄糖脱氢酶活力的降低和油脂积累程度有直接的联系.因此研究6-磷酸葡萄糖脱氢酶在产油藻类中的调控作用，对于实现提高产油生物中的油脂含量具有重大意义。
[0010]近年来6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)受到普遍关注，在动物、酵母、人类、植物中做了很多研究来探究G6PD 的功能(Zhang, 2008#93).(Lojudice, 2001#102) (Legan, Rebrin etal.2008)(Wang, 2012#90)。
[0011]G6ro还参与脂肪酸的生物合成。Gero催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6H)是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salati and Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75%的还原力(R.Rognstadl979)。G6H)基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien，1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括Gero同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6ro是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan，2009#50)。
[0012]G6H)是众多参与脂肪生物合成的酶中唯—个参与多个代谢路径的酶，目前许多关于该酶的研究表明 G6ro与细胞生长、抵抗胰岛素、高脂血、心血管疾病、糖尿病以及动物体内的氧化应激等相关。(Batetta, Bonatesta et al.2002) (Park, Rho et al.2005)(Gupte2008, Legan, Rebrin et al.2008, Schneider, Rawat et al.2012)。在调控NADPH的生成及氧化还原平衡中起着重要的作用，还能够有效地调控细胞分化，细胞生长以及物质代谢。G6TO在G6TO缺陷的人纤维细胞中的异位表达能够有效地阻止缺陷细胞的生长迟缓以及细胞早衰。(Ho，2000#83)。G6H)基因的上调与黑腹果蝇的寿命延长以及肿瘤性转化包括胃癌(Wang, 2012#103)肾细胞癌，(Langbein，2008#106)，纤维肉瘤(Frederiks, 2006#105)等显著相关。同样，还有报道称在G6H)缺陷的外周血淋巴细胞及单核细胞中，G6H)的低表达能够抑制胆固醇代谢和细胞生长(Batetta, Bonatesta etal.2002) 0这些研究能够充分说明G6H)对于细胞生长的重要作用。另外还有研究表明胚外组织的Gero活性的严重缺陷能够导致氧化还原平衡的混乱，导致细胞生长的调剂异常最终胚胎死亡(Longo，2002#80)。由以上研究可知G6H)对于机体的正常生长以及适应外界环境有重要的作用。
[0013]研究表明提高G6H)的表达量，提高G6ro的酶活，可提高NADPH的合成，还有研究报道提高G6ro的表达能够促进大部分脂肪基因的表达。G6ro在脂质的生物合成路径中发挥显著的作用，在人类肝脏中过表达Gero基因能够提高细胞内甘油三酯和游离脂肪酸的含量并能促进脂肪细胞中游离脂肪酸的释放，并能增加脂肪细胞因子的表达、刺激胰岛素抵抗。尽管脂质生物合成的增加与Gero活性的增加紧密相关，但是具体的相互作用机制相当复杂至今还未能完全研究清楚(Schneider, Rawat et al.2012)。在动物中，G6PD的过表达同样能够刺激肥胖动物的脂肪生成，G6PD的过表达与脂肪酸代谢物包括游离脂肪酸(FFAs)和甘油三酯(TAG)的增加相关。与正常的脂肪细胞相比，过表达G6H)基因的3T3-L1细胞中的G6H)活性提高了 1.4倍，使得过表达G6H)基因的细胞中脂肪滴变多变大(Park, Rho et al.2005)。通过基因改造可以啤酒酵母菌也能够产生高水平的G6H)活性以及G6H)基因的表达量。(Lojudice, 2001#102)。有研究表明G6H)基因的过表达与血脂异常相关，在过表达Gero的肥胖小鼠中，游离脂肪酸达到了相当高的水平。与正常的小鼠心脏相比，过表达G6H)的小鼠心脏G6H)基因的表达量增加了 10倍，G6PD活性增加了 2倍(Gupte2008)。在另外的研究中也表明在患有糖尿病的肥胖小鼠肝脏中G6H)也明显增加(Gupte, Floyd et al.2009)。相应的，敲除G6H)基因能够抑制肥胖小鼠的脂肪生成。G6ro缺陷的细胞中脂肪细胞的分化减弱，脂肪滴积累的数量变少，脂肪滴变小，细胞内游离脂肪酸以及甘油三酯的积累水平明显降低(Park，Rho et al.2005)。G6H)缺陷的个体同样表现出β -羟_β -甲戊二酸单酰辅酶a以及3—羟基一3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性相应的降低，从而导致胆固醇以及低密度脂肪酸合成减少(Meloni，Manca etal.2008)., (Batetta, Bonatesta et al.2002)。酵母水解产物的补充能够通过下调肥胖小鼠肝脏中G6H)的活性从而抑制脂肪酸的合成，使得小鼠脂肪积累减(Jung，2012#40)。通过小干扰RNA敲除G6ro基因会降低细胞内脂质积累、阻碍重要的脂肪基因的表达(Park, Rho et al.2005)。在G6H)缺陷病人中，血清蛋白的浓度以及脂质生成的速率都会降低(Dessi, Ch1dino et al.1986, Dessi, Batetta et al.1992)。G6PD 活性与代谢显著相关，尤其是紧密参与多不饱和脂肪酸的代谢。Gero的活性会因饮食中糖类的刺激而增加，在食入的多不饱和脂肪酸刺激下降低(Salati, 2001#52)。
[0014]G6PD在人类及动物中有较多研究，以上这些结果表明提高G6H)的表达能够促进脂肪酸合成的可能性。但是迄今Gero在植物及藻类中缺乏研究。此发明中，借鉴人类及动物研究中Gero基因与脂肪和成紧密相关、Gero活性增加能够促进脂肪合成，在藻类中通过过表达G6ro基因使得G6ro基因表达量提高，从而使得G6ro活性显著提高，使得藻的脂肪酸合成增加以及脂肪酸成分发生变化。
【发明内容】
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[0015]本发明的第一个目的是提供一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体。
[0016]本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，是一个多功能的微藻转化载体。该重组载体包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌Pl启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌CCdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。
[0017]所述的大肠杆菌Pl启动子的序列如SEQ ID N0.1所示,大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID N0.3所示，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQID N0.5 所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
[0018]所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
[0019]所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID N0.8所示。
[0020]所述的抗性筛选基因，优选为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示。
[0021]所述的表达盒是指含有启动子、目的基因或目的基因克隆位点和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列。
[0022]所述的融合为本领域技术人员所熟知的DNA片段连接技术。
[0023]不依赖于连接反应的高效克隆方法(LIC)属于现有技术。
[0024]本发明的第二个目的是提供所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。
[0025]所述的微藻，优选为三角褐指藻。
[0026]本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体包括2个基因表达盒，一个为筛选标记基因表达盒，另一为目的基因表达盒。筛选标记基因表达盒集成了真核和原核的表达盒，采用氯霉素酰基转移酶基因作为抗性筛选基因，其上游融合了来自大肠杆菌的Pl启动子和三角褐指藻fcpC基因启动子，下游融合了大肠杆菌CCdB终止子和三角褐指藻fcpA基因终止子。该融合表达盒使得氯霉素酰基转移酶基因既能在大肠杆菌中表达，又能在三角褐指藻中表达。该设计有效减小了表达载体的大小，便于载体的克隆操作以及高效的转化。本发明中采用了三角褐指藻的内源性的高效启动子fcpC，fcpC与三角褐指藻的光合作用相关，因此具有极高的启动效率，是理想的构建载体元件。
[0027]目的基因表达盒，用于表达外源基因，采用三角褐指藻的高表达水平的fcpC基因的启动子及终fcpA基因的终止子。目的基因表达盒内通过特别设计的2个XcmI内切酶位点引入了 TA克隆的连接方式。XcmI酶切线性化的载体即可直接一个步骤克隆Taq聚合酶PCR的产物。在三角褐指藻fcpC基因启动子的后面融合了一个Omega leader序列，曾有相关研究表明，把CaMV35S启动子-419~_90(E12)序列与omega序列相串联，⑶S基因在转基因烟草中有最大的表达活性。用这种结构增强⑶S基因表达，在转基因烟草中⑶S活性比仅仅用CaMV35S启动子高20-70倍(Mitsuhara et al., 1996)。由此可以看出，omega序列具有提闻启动子活性进而提闻目的基因表达的作用。
[0028]在三角褐指藻fcpA基因终止子的前面，添加的另外一个序列MYC-tag，具有高效，可靠，稳定的特性属于被广泛应用的成熟的理想的蛋白标签。在1985年就有相关文献报道将MYC序列位于终止密码子之前,用于western blot检测目的基因的表达(Evan etal.，1985)。MYC-tag应用于本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，可以解决一些后续载体的应用问题。例如在载体携带三角褐指藻的内源性基因进行过表达研究时，因为无内源性基因表达的蛋白与藻细胞内自身表达的蛋白相同，无法使用特定的抗体进行检测，MYC标签可以方便可靠的检测出基因是否成功的导入了细胞中。另一方面，对于其他非三角褐指藻内源性的基因的携带导入实验中，也可以不必再针对不同的蛋白而使用不同的抗体，而可以统一使用MYC抗体进行检测，节约了成本。
[0029]本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。
[0030]本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体能够在微藻中进行过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因。G6H)催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6H)是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salatiand Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75%的还原力(R.Rognstadl979)。G6H)基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien，1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括Gero同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6ro是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan，2009#50)。通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
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[0031]图1为目的基因表达盒构建图；
[0032]图2为pHY18表达载体结构图，Pnr/Tnr:硝酸还原酶启动子/终止子；PfcpC:三角褐指藻fcpC启动子，TfcpA:三角褐指藻fcpA终止子；CAT:氯霉素乙酰转移酶基因；0ri:PUC19质粒复制起点；
[0033]图3为CAT在大肠杆菌和三角褐指藻中的表达，A左为商业化载体pMD19_T转化大肠杆菌；A右为pHY18载体转化大肠杆菌(LB培养基含35mg L-1氯霉素)；B左为转化载体pHY18-eGFP的三角褐指藻生长在250mg L—1氯霉素f/2_si培养基中，B右为野生型三角褐指藻；
[0034]图4PCR验证和微藻蛋白质印迹分析，A为用引物P201和P202PCR扩增转化eGFP基因融合，其中，泳道1:转基因株系，泳道2:未转基因藻株，泳道M:100bp Marker，箭头表示0.7-kb的eGFP的条带；B为Western blot分析用抗Myc及抗GFP抗体检测绿色突光蛋白，β-actin作为内部对照基因和探讨，泳道1:未转基因藻株，泳道2:转基因株系；
[0035]图5共聚焦显微镜观察eGFP基因，A为转基因三角褐指藻株，B为未转化的三角褐指藻B;
[0036]图6为基因的PCR扩增结果图，泳道M为Ikb的ladder marker ;泳道I为G6ro基因的扩增结果；
[0037]图7为G6F*D基因编码的蛋白序列的进化树；
[0038]图8为Ρ?66Η)_ρΗΥ18重组质粒的Sal I酶切图，泳道M为Ikb的ladder marker ；泳道I为PtG6ro-pHY18重组质粒；泳道2为PtG6ro_pHY18重组质粒的Sal I酶切结果；
[0039]图9为PtG6ro_pHY18重组质粒的引物图谱；
[0040]图10为抗生素筛选阳性三角褐指藻的培养结果照片，其中，A为200mg.L—1氯霉素平板筛选阳性藻的照片，Wild type为未转化藻，Transgenic为转化藻；B为200mg.L—1氯霉素浓度的f/2培养基培养转化藻和未转化藻,Wild type为未转化藻,Transgenic为转化藻；
[0041] 图11为转化藻的MYC蛋白的Western blot分析图,其中，control为未转化藻，G6PD1为转化藻株I ;G6PD2为转化藻株2 ；
[0042]图12为G6H)基因表达蛋白的蛋白定位的胶体金免疫电镜图，A为过表达G6H)基因的转基因三角褐指藻，B为野生型的三角褐指藻，标尺大小为500nm。
[0043]图13为转化藻中的G6H)基因的qPCR分析图；
[0044]图14为转化藻的G6H)的酶活检测结果；
[0045]图15A为每ml藻液的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；B为尼罗红染色测定每16细胞的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；C为转化藻和未转化藻的生长曲线；D为转化藻和未转化藻缺氮48小时和96小时后的中性脂质含量；
[0046]图16为转化藻和未转化藻的激光扫描共聚焦显微镜检测图,A为未转化藻；B为转化藻。
【具体实施方式】
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[0047]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0048]本发明所使用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、NEB高保真Pfu聚合酶(购自NewEngland B1labs1USA);所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大肠杆菌DH5ci感受态细胞购自广州鼎国生物有限公司。
[0049]过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体构建过程中所使用的引物序列如表I所示。
[0050]表1:载体设计中使用的引物
[0051]
【权利要求】
1.一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌Pl启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌CCdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列,所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游； 所述的大肠杆菌Pl启动子的序列如SEQ ID N0.1所示,大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID N0.2所示,三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID N0.3所示,6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQ IDN0.5 所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
2.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，其中在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID N0.8所示。
4.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的抗性筛选基因为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示。
5.权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。
6.根据权利要求5所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用，其特征在于，所述的微藻为三角褐指藻。
【文档编号】C12N1/13GK104131025SQ201410329135
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】李宏业, 薛姣, 杨维东, 刘洁生 申请人:暨南大学