小麦4b染色体粒重qgw4b-caps分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种小麦4B染色体粒重QGW4B-CAPS分子标记及其应用，粒重控制基因位点QGW4B-17位于小麦4B染色体短臂31.3～36.3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_c101685_705和分子标记RAC875_c27536_611之间；本发明还公开了根据根据粒重控制基因位点QGW4B-17开发的粒重QGW4B-CAPS分子标记。本发明所述分子标记QGW4B-CAPS可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的大粒资源，并将这些大粒资源用于高产小麦育种或分子设计聚合杂交育种，以及应用该标记进行分子标记辅助选择育种，以更快速、准确进行高产小麦品种的选育。
【专利说明】小麦4B染色体粒重QGW4B-CAPS分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小麦4B染色体粒重QGW4B-CAPS分子标记及其应用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界三大粮食作物之一，是我国北方人口的主要口粮。随着我国人均耕地 土地和淡水资源的减少，粮食供应安全问题日益凸显。千粒重是小麦产量构成三要素之一， 提高小麦粒重是培育高产小麦的重要途径。
[0003] 粒重由主基因和微效基因共同控制的数量性状，基因数目多且效应较低，易受环 境影响。在传统育种中需要大规模的田间选择，工作量大，效率低。小麦是异源六倍体，与 粒重有关的基因鉴定较少，缺乏分子标记辅助选择的有效标记。
[0004] 目前小麦粒重分子标记辅助选择存在的主要问题是：绝大多数QTLs不是功能性 标记，多数发表的QTLs位点都没有经过育种过程或品种进行有效性验证；QTLs实用性差， 单一遗传群体定位的基因位点，准确度差，而且由于置信区间大，QTLs过多或存在假阳性 QTLs，降低了分子辅助选择的实际效率，甚至没法有效应用到小麦育种中。
[0005] 实效性分子标记能够避免由于高比率的重组交换而产生的选择错误，在群体的目 标基因检测时更加有效；直接反映目标性状的表现，可以准确的检测、跟踪目标基因，且其 遗传效应值具有普适性，且可靠性高，对人工育种群体和自然群体均有效。在利用回交转育 高千粒重性状时，实效性标记的开发有助于推动分子标记辅助选择的应用，而且有利于在 种质资源中发掘有利基因。
[0006] 作为第三代分子标记的 SNP (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)，标记是一 种基于多态性SNP和PCR为基础的分子标记技术。本发明是以RIL群体为材料，在SNPs全 基因组扫瞄的基础上，利用连锁分析方法，提高了 QTL检测的效应和定位精度，开发了实效 性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记，研制粒重分子辅助育种体 系，可以程序化应用于育种实践。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种小麦4B染色体粒重基因分子标记 QGW4B-CAPS及其应用。
[0008] 小麦4B染色体控制粒重基因位点QGW4B-17,粒重控制基因位点QGW4B-17位于小 麦4B染色体短臂31. 3?36. 3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_cl01685_705和分子 标记 RAC875_c27536_611 之间。
[0009] 根据上述小麦4B染色体控制粒重基因位点QGW4B-17左侦彳SNP开发的 QGW4B-CAPS1分子标记，该分子标记上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核 苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0010] 上述根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记在 分子辅助育种中的应用。
[0011] 上述应用，步骤如下：
[0012] (1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0013] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子标记作为特 异引物对基因组DNA中进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0014] (3)用限制性内切酶Alul酶切步骤（2)制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
[0015] (4)对步骤（3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显 示被测样品在439bp和177bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制位点QGW4B-17的 品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在722bp有条带时，则该被检测样品为不含有粒重 控制位点QGW4B-17的品种。
[0016] 根据本发明优选的，所述的步骤（2)中PCR扩增体系为20 μ L，具体如下：
[0017] 2XEs Taq MasterMixlOy L(购自北京康为世纪生物科技有限公司）， QGW4B-CAPS1分子标记的上游引物0. 8 μ L，QGW4B-CAPS1分子标记的下游引物0. 8 μ L，模板 3 μ L，无菌 Η205· 4 μ L。
[0018] 根据本发明优选的，所述的步骤（2)中PCR扩增程序如下：
[0019] 94°C预变性 5min ;94°C变性 40s，59°C退火 45s，72°C延伸 50s，35 个循环；72°C延 伸 lOmin。
[0020] 根据本发明优选的，所述的步骤（3)中酶切体系为10 μ L，具体如下：
[0021] 限制性内切酶 AluIO. 3 μ L，PCR 扩增产物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L， ddH206 μ L ；
[0022] 酶切条件为：37°C水浴lh，然后65°C灭活5min。
[0023] 根据上述小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17右侧SNP开发的QGW4B-CAPS2分 子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /_J、1 ο
[0024] 上述应用，步骤如下：
[0025] (1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0026] (2)以步骤⑴制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子标记作为特 异引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0027] (3)用限制性内切酶Apall酶切步骤⑵制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
[0028] (4)对步骤（3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显 示被测样品有415bp和323bp条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的 品种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在738bp有条带时，则该被检测样品含有粒重控制 位点QGW4B-17的品种。
[0029] 根据本发明优选的，所述的步骤（2)中PCR扩增体系为20 μ L如下：
[0030] 2XEs Taq MasterMixlO yL(购自北京康为世纪生物科技有限公司）， QGW4B-CAPS2分子标记的上游引物0. 8 μ L，QGW4B-CAPS2分子标记的下游引物0. 8 μ L，模板 DNA3 μ L，无菌 Η205· 4 μ L。
[0031] 根据本发明优选的，所述的步骤（2)中PCR扩增程序如下：
[0032] 94°C预变性 5min ;94°C变性 40s，59°C退火 45s，72°C延伸 50s，35 个循环；72°C延 伸 lOmin。
[0033] 根据本发明优选的，所述的步骤（3)中酶切体系为10 μ L，具体如下：
[0034] 限制性内切酶 Apal 10. 3 μ L，PCR 扩增产物 3 μ L，10XNE bufferO. 7 μ L， ddH206 μ L ；
[0035] 酶切条件为：37°C水浴lh，然后65°C灭活5min。
[0036] 上述提取待鉴定样品的基因组DNA的方法也采用本领域常规的改良的CTAB法提 取叶片中的DNA。
[0037] 有益效果
[0038] 本发明根据小麦4B染色体粒重主效QTLs位点SNP开发的特异CAPS分子标记 QGW4B-CAPS，该标记可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的大粒资源，并将这些大 粒资源用于高产小麦育种或分子设计聚合杂交育种，以及应用该标记进行分子标记辅助选 择育种，以更快速、准确进行高产小麦品种的选育。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为小麦千粒重基因在染色体4B染色体上的作图区间；
[0040] 图中：右侧是分子标记的名称，左侧数字是标记之间的遗传距离，单位是cM。
[0041] 图2为大小粒亲本及衍生品系利用QGW4B-CAPS1分子标记进行PCR扩增，扩增产 物酶切前后的电泳条带图；
[0042] 图中：1、Marker ;2、大粒亲本01-35酶切前；3、大粒亲本01-35酶切后；4、小粒株 系C60酶切前；5、大粒株系C98酶切前；6大粒株系C98酶切后；7小粒株系C60酶切后；8 小粒亲本藁城9411酶切前；9小粒亲本藁城9411酶切后。
[0043] 图3为大小粒品种及育种高代品系用QGW4B-CAPS1分子标记进行PCR扩增，扩增 产物酶切前后的电泳条带图；
[0044] 图中：1-5为大粒品种鲁原205,临麦2,淄麦12,潍麦8号，豫农949酶切前；6-10 为大粒品种鲁原205,临麦2,淄麦12,潍麦8号，豫农949酶切后；11-15为小粒品种跃进5 号，碧玛6号，西农979,师溧02,藁城8901酶切前；16-20为小粒品种跃进5号，碧玛6号， 西农979,师溧02,藁城8901酶切后。
[0045] 图4为大小粒亲本及衍生品系用QGW4B-CAPS2分子标记进行PCR扩增，扩增产物 酶切前后的电泳条带图；
[0046] 图中：01-35X藁城9411F9:10RIL群体大小粒株系酶切前后电泳图；1-5RIL群 体大粒 C25, C47, C53, C76, C98 酶切前，6-10 大粒株系 C25, C47, C53, C76, C98 酶切后； 11-15RIL 群体小粒株系 C27, C36, C44, C60, C114 酶切前，16-20 小粒株系 C27, C36, C44， C60，C114酶切后；
[0047] 图5为大小粒品种及育种高代品系用QGW4B-CAPS2分子标记进行PCR扩增，扩增 产物酶切前、后的电泳条带图；
[0048] 图中：1-5大粒品种鲁原205,临麦2,淄麦12,潍麦8号，豫农949酶切前；6-10大 粒品种鲁原205,临麦2,淄麦12,潍麦8号，豫农949酶切后；11-15小粒品种跃进5号，碧 玛6号，西农979,师溧02,藁城8901酶切前；16-20小粒品种跃进5号，碧玛6号，西农979， 师溧02,藁城8901酶切后；21-25为5个淄麦12 X师溧02育种后代F5大粒品系酶切前； 26-30为5个淄麦12 X师溧02育种后代F5大粒品系酶切后；31-35为5个淄麦12 X师溧 02育种后代F5小粒品系酶切前；36-40为5个淄麦12 X师溧02育种后代F5小粒品系酶 切后。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0050] 实施例1
[0051] 小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17,粒重控制位点QGW4B-17位于小麦4B染 色体短臂31. 3?36. 3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_cl01685_705和分子标记 RAC875_c27536_611 之间。
[0052] 遗传图谱构建和QTL定位实验室构建的RIL群体为材料：该RIL群体以普通小麦 品系山农01-35为母本，藁城9411为父本进行杂交，获得F1代，经一粒传法自交9代，得到 含173个家系的RIL(F 9:1Q)群体。
[0053] 母本山农01-35是山东农业大学育成的大粒、中筋、成穗率较低的小麦品系，普通 市售产品；
[0054] 父本藁城9411是河北省藁城农科所育成的小粒、分蘖成穗率较高的强筋小麦品 系，普通市售产品。
[0055] 分子标记的检测
[0056] 提取亲本及后代群体的DNA，取待鉴定样品的基因组DNA的方法采用本领域常规 的改良的CTAB法提取叶片中的DNA。
[0057] DArT标记的检测及序列信息由澳大利亚Triticarte Pty. Ltd (http://www. triticarte. com, au)完成。
[0058] SNP标记由美国加利弗尼亚大学戴维斯分校植物科学系生物技术检测中心利用 Illumina SNP Genotyping技术测试平台，使用微珠芯片技术（BeadArray)进行检测。其多 态性分析使用genomestudio软件进行分析。
[0059] SSR标记利用两亲本进行多态性筛选，将多态性引物用于RIL群体的检测，SSR引 物的序列等信息通过参考文献和 GrainGene2. 0 (http: //wheat, pw. usda. gov/GG2/index, shtml)获得。
[0060] 图谱构建及QTL数据分析
[0061] 用MAPMAKER/EXP3. Ob软件]和Mapchart2. 1构建分子标记的连锁图。用基于混 合线性模型的QTL network2. 0软件对2008年-2010年泰安点和2010宿州4个环境下粒 重的表型值和其平均值分别单独进行QTL定位，并利用4个环境的粒重的表型值共同进行 多环境的QTL分析。获得了多个环境下稳定表达的主效QTL位点，该位点定名为QGW4B-17。 在染色体上的具体位置如图1所示。
[0062] 根据上述结果，设计分子标记如下：
[0063] 根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分子标记，上游 引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0064] 根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分子标记，上游 引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0065] 实施例2
[0066] 实施例1所述的根据小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的分子标记在分 子辅助育种中的应用，即为将与小麦千粒重主效QTL紧密连锁的分子标记用于检测小麦品 种或品系的方法，该方法它包括以下步骤：
[0067] 1.分子标记在华大基因等生物技术公司合成，序列如下：
[0068] QGW4B-CAPS1 :上游引物：5，-TAATAGGCTTGAAAAGTTCTTAC-3，，SEQ ID NO. 1
[0069] 下游引物：5，-CGAATAGACTTCAGGGGCA-3，；SEQ ID NO. 2
[0070] QGW4B-CAPS2 :上游引物：5，-CCCGGTTTTATGAACGATGAGTGG-3，；SEQ ID NO. 3
[0071] 下游引物：5，-GCGTGACAATTGCCACAGATCTA-3。SEQ ID NO. 4
[0072] 2.提取检测材料 DNA :参照 Triticarte Pty. Ltd(http://www. triticarte. com. au)中提供的植物DNA提取方法，用0. 8wt%琼脂糖电泳检测DNA质量和浓度，其详细方法 如下：
[0073] (1)取0· 3-0. 5g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末。
[0074] (2)加入1600 μ L已预热至65°C的缓冲液，多次倒置混匀，水浴0· 5-lh，（其间轻 摇几次以充分混匀）。
[0075] (3)降温等待10分钟，加 10-15 μ L RNase (10mg/mL) 37°C水浴30钟（其间轻摇几 次以充分混匀，约1次/l〇min)。
[0076] (4)取出离心管，加入等体积160(^1^，41：苯酚（1^8-平衡酚） ：氯仿：异戊醇 (25 :24 :1)抽提，轻轻混匀10min(可水平放置在摇床上），4°C冰箱静置5min，然后8000rpm 离心10min。
[0077] (5)取上清液于另一管，约1300yL，加入等体积冷氯仿（4°C冰箱放置），轻摇 10min混勻（可水平放置在摇床上），8000rpm离心10min。
[0078] (6)取上清液于另一管（约1000 μ L)加100 μ L3M NaAC(醋酸钠），加入1000 μ L 的冷异丙醇（或2倍体积的冷乙醇），充分混匀后于-20°C冰箱静置20min。
[0079] (7)用枪头挑出絮状的DNA，用70%乙醇清洗2-3次，稍离心5分钟，去掉乙醇，气 干后（无乙醇气味即可），溶于200 μ LI XTE溶液中，轻轻混匀，-20°C储存。
[0080] (8)用微量可见/紫外分光光度计NanoDrop2000,测定DNA浓度，稀释DNA浓度为 200ng/ μ L做为工作液。
[0081] 附录：溶液配制：
[0082] (a) 3M NaAc (pH5. 2)
[0083] 600mL H20中加408. 24g NaAc-3H20,（或者246. 24g无水醋酸钠）溶解后用冰醋 酸（冰乙酸）调pH值至5· 2,定容至1L，灭菌，备用。
[0084] (b) 1 X TE 溶液
[0085] 800mL H20 中加 1. 211g Tris、0. 3723g Na2EDTA-2H20,用 HC1 调 pH 值至 8. 0,定容 至1L，灭菌，备用。
[0086] (c)RNA酶（RNase):(若商业化配置好的lmL处理好的分装RNA酶，可以直接使 用）。
[0087] 将固体RNA酶溶于0· 01M NaAc，使酶浓度为10mg/mL，加热至100°C处理15 - 20min，慢慢冷却至室温，然后加入0. 1倍体积1M Tris-HCl (pH7. 4)，分装后于-20°C冰箱 保存。
[0088] ⑷缓冲液：按照如下配方配制后，定容至1L。
[0089]
【权利要求】
1. 小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17,粒重控制基因位点QGW4B-17位于小麦4B 染色体短臂31. 3?36. 3cM处，处于小麦4B染色体分子标记Ex_cl01685_705和分子标记 RAC875_c27536_611 之间。
2. 根据权利要求1所述小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分 子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
3. 权利要求2所述根据小麦4Β染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS1分 子标记在分子辅助育种中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下： (1) 提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液； (2) 以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子标记作为特异引 物对基因组DNA中进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； (3) 用限制性内切酶Alul酶切步骤（2)制得的PCR扩增产物，得酶切产物； (4) 对步骤（3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示 被测样品在439bp和177bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制位点QGW4B-17的品 种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在722bp有条带时，则该被检测样品为不含有粒重控 制位点QGW4B-17的品种。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2)中PCR扩增体系为20 μ L， 具体如下： 2XEs Taq MasterMixlO μ L，QGW4B-CAPS1 分子标记的上游引物 0· 8 μ L，QGW4B-CAPS1 分子标记的下游引物〇. 8 μ L,模板3 μ L,无菌Η205. 4 μ L ; 所述的步骤（2)中PCR扩增程序如下： 94°〇预变性5!1^11;941：变性4〇8,591：退火458,721：延伸5〇8,35个循环；721：延伸 10min〇 所述的步骤（3)中酶切体系为10 μ L，具体如下： 限制性内切酶 AluIO. 3 μ L，PCR 扩增产物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L，ddH206 μ L ; 酶切条件为：37°C水浴lh，然后65°C灭活5min。
6. 根据权利要求1所述小麦4B染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分 子标记，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /_J、1 ο
7. 权利要求6所述根据小麦4Β染色体粒重控制位点QGW4B-17开发的QGW4B-CAPS2分 子标记在分子辅助育种中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下： (1) 提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液； (2) 以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子标记作为特异引 物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； (3) 用限制性内切酶Apall酶切步骤（2)制得的PCR扩增产物，得酶切产物； (4) 对步骤（3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示 被测样品有415bp和323bp条带时，则该被检测样品为不含有粒重控制位点QGW4B-17的品 种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在738bp有条带时，则该被检测样品为含有粒重控制 位点QGW4B-17的品种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2)中PCR扩增体系为20 μ L如 下： 2XEs Taq MasterMixlO μ L，QGW4B-CAPS2 分子标记的上游引物 0· 8 μ L，QGW4B-CAPS2 分子标记的下游引物〇. 8 μ L,模板3 μ L,无菌Η205. 4 μ L ; 所述的步骤（2)中PCR扩增程序如下： 94°〇预变性5!1^11;941：变性4〇8,591：退火458,721：延伸5〇8,35个循环；721：延伸 10min〇 所述的步骤（3)中酶切体系为10 μ L，具体如下： 限制性内切酶 Apal Πλ 3 μ L，PCR 扩增产物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L，ddH206 μ L ; 酶切条件为：37°C水浴lh，然后65°C灭活5min。
【文档编号】C12Q1/68GK104087580SQ201410329392
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】陈建省, 田纪春, 李青芳, 刘凯, 陈广凤, 谷植群 申请人:山东农业大学